陳旭東

（山東省立第三醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，山東 濟南250031）

趨化因子是由白細胞、樹突狀細胞、血小板等多種細胞產(chǎn)生，分子量較小（8～10 kD）、具有趨化活性的蛋白質(zhì)。在先天、適應性免疫系統(tǒng)、穩(wěn)態(tài)、血管生成及擴張、炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過程中，趨化因子發(fā)揮重要作用。趨化因子是具有7 次跨膜區(qū)域的G 蛋白耦聯(lián)受體，位于血小板、中性粒細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、T 細胞等細胞中。由于趨化因子受體是潛在的治療靶點，目前趨化因子受體已被廣泛研究。臨床上已經(jīng)開發(fā)出針對趨化因子的受體拮抗劑和單克隆抗體[1-2]。小分子CXCR2 和CCR1 拮抗劑已應用于幾種炎癥疾病動物模型，雙抗CCR3 和抗H1-拮抗劑也被證實可緩解人類過敏性鼻炎癥狀[3]。

過敏是系統(tǒng)性疾病，其系統(tǒng)性行為和局部產(chǎn)生的介質(zhì)能夠刺激骨髓和淋巴器官，由此產(chǎn)生炎癥細胞并釋放至血液，炎癥細胞最終從血液中募集至炎癥部位[4]。支氣管哮喘是嗜酸性粒細胞和Th2 細胞主導的慢性炎癥疾病。此外，T 細胞毒性細胞等其他T細胞亞群在支氣管哮喘中也發(fā)揮重要作用，特別是在急性哮喘發(fā)作導致死亡的時候[5]。在炎癥因子刺激作用下，機體從血液中募集T 細胞及其他白細胞至支氣管炎癥位點并產(chǎn)生趨化因子。目前關(guān)于趨化因子受體的研究，均在支氣管肺泡灌洗液、誘導痰或呼吸道上皮纖毛中進行[6-7]。本研究通過評估不同嚴重程度哮喘患者外周血CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞趨化因子受體表達情況，分析不同嚴重程度支氣管哮喘患者CD3+T細胞趨化因子受體表達的差異。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2017年12月山東省立第三醫(yī)院就診的40 例支氣管哮喘患者。依據(jù)《支氣管哮喘防治指南（2016年版）》[8]，將患者分為輕、中度支氣管哮喘患者組23 例，平均年齡（36.1±8.1）歲，哮喘持續(xù)時間為（11.2±1.8）年，第1 秒用力呼氣容積占用力肺活量比值（FEV1%）（91.2±7.8）%；重度支氣管哮喘患者組17 例，平均年齡（32.3±9.2）歲，哮喘持續(xù)時間為（12.3±2.4）年，F(xiàn)EV1%（59.5±2.4）%；兩組患者年齡、哮喘持續(xù)時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組FEV1%差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。納入同期本院體檢的27 例肺功能正常的健康志愿者作為對照組，平均年齡（35.8±7.6）歲。基于每日吸入糖皮質(zhì)激素（布地奈德）的劑量，將本研究納入的23 例輕、中度哮喘患者又分為＜400 μg/g 組11 例、400～800 μg/g 組5 例和＞800 μg/g 組7 例?；诨颊逨EV1%預計值，將本研究納入的40 例哮喘患者分為FEV1%預計值≤80%組12 例和FEV1%預計值＞80%組28 例。哮喘患者和健康志愿者入組采血前4 周內(nèi)均未發(fā)生呼吸道感染。哮喘患者和健康志愿者年齡匹配，且均為非吸煙者。排除標準：其他全身性炎癥和慢性疾病，需要全身用糖皮質(zhì)激素。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者家屬知情并簽署知情同意書。

分級標準：①輕度：患者步行或上樓梯時氣短，可平臥，說話可連續(xù)成句，精神狀態(tài)尚可；體格檢查無輔助呼吸肌活動及三凹征，哮鳴音不明顯，心率（HR）＜100 次/min；實驗室檢查氧分壓正常，二氧化碳分壓（PCO2）＜45 mmHg，血氧飽和度（SpO2）＞95%。②中度：患者輕微活動后即感覺氣短，端坐呼吸，說話斷斷續(xù)續(xù)，精神狀態(tài)可，偶有焦慮和煩躁；體格檢查偶有輔助呼吸肌活動及三凹征，哮鳴音清晰并廣泛存在，HR＜120 次/min；實驗室檢查氧 分 壓（PO2）60～80 mmHg，PCO2≤ 45 mmHg，SpO291%～95%。③重度：患者休息時也能感覺到氣短，端坐呼吸，說話只能說詞語或單字，精神狀態(tài)差，焦慮煩躁明顯；體格檢查有輔助呼吸肌活動及三凹征，哮鳴音清晰并廣泛存在，HR ＞120 次/min；實驗室PO2＜60 mmHg，PCO2＞45 mmHg，SpO2≤90%。

患者目前使用的藥物包括短效和/或長效β-2激動劑、白三烯調(diào)節(jié)劑和吸入性糖皮質(zhì)類固醇類（布地奈德每日劑量不超過1 600 μg/g）。輕、中度支氣管哮喘組23 例患者中11 例日常吸入糖皮質(zhì)激素（布地奈德）的劑量＜400 μg/g，5例吸入劑量400～800 μg/g，7 例吸入劑量＞800 μg/g；重度支氣管哮喘組患者吸入劑量每日均超過800 μg/g。

1.2 采用流式細胞儀檢測CD3+CD8+和CD3+CD8-T細胞上CXCR1、CXCR2、CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8等趨化因子受體的表達情況

入組后次日清晨，收集所有受試者7 mL 全血，EDTA 抗凝，6 h 內(nèi)完成檢測。采用20 μL PerCP 標記的CD3，20 μL FITC 標記的CD8，20 μL PE 標記的CXCR1、CXCR2、CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8 對細胞進行染色。下列采用PE 標記的同型抗體作為對照：小鼠抗人CXCR1 IgG2b、小鼠抗人CXCR2 和CCR3 IgG1、小鼠抗人CXCR3 IgG1、小鼠抗人CCR4 IgG2b、小鼠抗人CCR5 IgG2a、大鼠抗人CCR7 IgG2a、小鼠抗人CCR8 IgG2b?；旌虾蟀凳覂?nèi)常溫孵育15 min，孵育10 min 后加入FACS 裂解溶液2 μL，然后將樣品離心5 min并除去上清液。采用配備有氬激光器的BD FACSCalibur 流式細胞儀進行分析，數(shù)據(jù)采集及分析采用Cell Quest Pro軟件。

1.3 肺功能的檢測

采用德國耶格Master Screen PFT System 肺功能儀，所有受試者在同一技師的指導下完成肺功能檢查。測試前測量并記錄測試對象身高（cm）、體重（kg），受試者平靜狀態(tài)下采取坐位，技師給受試者夾上鼻夾，囑其戴好肺功能過濾器咬嘴，平靜呼吸2、3 次后，用最快的呼吸速度和最大的呼吸幅度做深呼吸，呼氣時間至少維持5 s，每位受試者均行3 次肺功能檢測，測定出FEV1%預計值的最佳值，將其進行整理并收集。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同嚴重程度支氣管哮喘患者CD3+CD8+T細胞上趨化因子受體表達情況

輕、中度支氣管哮喘組、重度支氣管哮喘組、對照組受試者CD3+CD8+T 細胞上CXCR1 陽性表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），重度支氣管哮喘組低于輕、中度支氣管哮喘組和對照組（P＜0.05），輕、中度支氣管哮喘組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組受試者CD3+CD8+T 細胞上CCR7 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），重度支氣管哮喘組低于對照組（P＜0.05），輕、中度支氣管哮喘組分別與重度支氣管哮喘組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組受試者CD3+CD8+T 細胞上CXCR2、CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR8 陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組受試者CD3+CD8+T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

表1 3組受試者CD3+CD8+T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

組別n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3輕、中度支氣管哮喘組重度支氣管哮喘組對照組F 值P 值23 17 27 9.81±4.62 4.83±2.14 9.75±5.25 41.734 0.001 2.92±1.46 2.63±0.76 2.67±1.26 0.346 0.710 27.54±4.18 26.06±6.22 25.9±9.85 0.328 0.727 6.72±1.16 7.19±2.72 7.43±2.02 0.611 0.547組別輕、中度支氣管哮喘組重度支氣管哮喘患者組對照組F 值P 值CCR4 8.94±1.41 8.17±1.35 8.67±1.15 1.783 0.177 CCR5 17.71±4.33 16.44±1.06 15.51±3.67 2.195 0.121 CCR7 8.78±2.98 6.52±1.59 11.66±5.45 28.917 0.001 CCR8 0.48±0.12 0.32±0.14 0.41±0.25 2.249 0.117

2.2 不同嚴重程度支氣管哮喘患者CD3+CD8-T細胞上趨化因子受體表達情況

3 組CD3+CD8-T 細胞上CXCR1 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），重度支氣管哮喘組低于輕、中度支氣管哮喘組和對照組（P＜0.05），輕、中度支氣管哮喘組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組CD3+CD8-T 細胞上CXCR2陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），重度支氣管哮喘組低于輕、中度支氣管哮喘組和對照組（P＜0.05），輕、中度支氣管哮喘組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組CD3+CD8-T細胞上CCR8 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），重度支氣管哮喘組低于輕、中度支氣管哮喘組和對照組（P＜0.05），輕、中度支氣管哮喘組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3 組CD3+CD8-T 細胞上CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5 及CCR7 陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組受試者CD3+CD8-T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

表2 3組受試者CD3+CD8-T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

組別n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3輕、中度支氣管哮喘組重度支氣管哮喘組對照組F 值P 值23 17 27 35.87±7.19 12.2±3.61 36.5±7.92 92.582 0.001 1.34±0.67 0.39±0.13 1.76±0.71 30.484 0.001 27.93±5.25 26.3±2.46 28.07±5.23 0.949 0.393 25.66±5.24 25.15±3.72 27.99±6.71 2.777 0.071組別輕、中度支氣管哮喘組重度支氣管哮喘組對照組F 值P 值CCR4 36.61±6.82 34.16±3.99 35.6±9.63 0.598 0.556 CCR5 42.02±5.92 41.31±6.91 39.04±5.33 2.629 0.082 CCR7 37.59±12.8 38.91±7.94 40.3±3.74 2.981 0.066 CCR8 0.41±0.25 0.13±0.07 0.32±0.17 21.482 0.001

2.3 不同劑量患者CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞上趨化因子受體陽性表達率比較

3 組不同劑量患者CD3+CD8+T 細胞上CXCR1 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=49.410，P=0.001），每天吸入布地奈德劑量＞800 μg/g 組低于400～800 μg/g 組和＜400 μg/g 組（P＜0.05），400～800 μg/g 組低于＜400 μg/g 組（P＜0.05）。3 組不同劑量患者CD3+CD8-T 細胞上CXCR1 陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=99.620，P=0.001），每天吸入布地奈德劑量＞800 μg/g 組低于吸入劑量400～800 μg/g 組和＜400 μg/g 組（P＜0.05），400～800 μg/g 組低于＜400 μg/g 組（P＜0.05）。見表3、4。

表3 不同劑量患者CD3+CD8+T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

表3 不同劑量患者CD3+CD8+T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

組別n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3＞800 μg/g 組400～800 μg/g 組＜400 μg/g 組F 值P 值7 5 1 1 5.34±2.28 8.19±4.16 11.65±5.31 13.824 0.007 2.76±1.67 2.87±1.75 2.95±1.88 1.718 0.374 25.67±6.54 26.43±7.08 26.34±6.96 0.894 0.381 5.77±2.05 6.14±1.97 6.43±2.24 0.927 0.408

2.4 患者肺功能與CD3+CD8-T細胞上趨化因子受體的關(guān)系

FEV1%預計值≤80%組和FEV1%預計值＞80%組患者CD3+CD8-T 細胞上CXCR1 陽性表達率分別為（39.27±2.63）%和（18.21±1.14）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.897，P=0.004），F(xiàn)EV1%預計值＞80%組低于FEV1%預計值≤80%組。

續(xù)表3

表4 不同劑量患者CD3+CD8-T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

表4 不同劑量患者CD3+CD8-T細胞上趨化因子受體陽性表達率的比較 （%，±s）

組別n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3＞800 μg/g 組400～800 μg/g 組＜400 μg/g 組F 值P 值7 5 1 1 16.6±3.11 27.69±7.15 42.22±6.28 99.623 0.001 0.81±0.27 0.94±0.29 0.86±0.17 1.394 0.257 25.92±3.17 28.17±6.39 31.74±6.97 2.475 0.189 17.23±4.52 34.53±3.37 26.08±3.42 1.286 0.298組別＞800 μg/g 組400～800 μg/g 組＜400 μg/g 組F 值P 值CXCR4 38.22±4.16 34.68±8.36 38.87±5.86 2.117 0.267 CXCR5 39.36±5.65 44.85±4.55 43.42±5.37 0.988 0.472 CXCR7 32.45±6.29 38.39±3.82 41.52±3.33 1.869 0.288 CCR8 0.16±0.08 0.39±0.26 0.57±0.06 1.999 0.274

3 討論

本研究評估CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞上趨化因子受體CXCR1、CXCR2、CCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8 的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：重度支氣管哮喘組CD3+CD8+T 細胞上CXCR1 和CCR7 陽性表達率低于對照組，重度支氣管哮喘組CD3+CD8+T細胞上CXCR1 陽性表達率低于輕、中度支氣管哮喘組。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)重度支氣管哮喘組CD3+CD8-T 細胞上CXCR1、CXCR2 和CCR8 陽性表達率低于輕、中度支氣管哮喘組和對照組。輕、中度支氣管哮喘組與對照組CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞上所有趨化因子受體的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義。與預期不一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)，對照組和輕、中度支氣管哮喘組CD3+CD8-T 細胞上CXCR1、CXCR2 和CCR8 陽性表達率低于重度支氣管哮喘組。

CXCR1 和CXCR2 主要在單核細胞/巨噬細胞、肥大細胞、平滑肌細胞和T 細胞中表達，能夠結(jié)合CXCL1/GROα、 CXCL2/GROβ、 CXCL3/GROγCCL5/ENA-78、CXCR6/GFP-2，CXCR7/NAP-2，CXCL8/IL-8等趨化因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，重度支氣管哮喘組CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞上CXCR1 陽性表達率低于輕、中度支氣管組和對照組。重度支氣管哮喘組CD3+CD8-T 細胞上CXCR2 陽性表達率低于輕、中度支氣管組和對照組。CXCR1 和CXCR2 主要功能是趨化和激活嗜中性粒細胞，但研究證實單核細胞、巨噬細胞、T 細胞、樹突狀細胞和平滑肌細胞中也具有類似功能[10]。重度支氣管哮喘患者外周血中至少有一種T 細胞上CXCR1 和CXCR 陽性表達率下降，提示趨化因子與T 細胞表面相應受體的結(jié)合能力下降，導致整合素CD11b 表達及其與內(nèi)皮細胞黏附能力受損。因此，重度支氣管哮喘患者T 細胞由血液循環(huán)遷移至氣道組織過程被削弱[11]。研究發(fā)現(xiàn)，重度支氣管哮喘患者上皮下膜中CXCR1 和CXCR2 mRNA 表達高于對照組，由于上皮下膜中中性粒細胞和嗜酸性粒細胞含量高[12]，因此，該結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

此外，CXCR1 和CXCR2 在慢性阻塞性肺疾病患者肺部殘留的上皮細胞和平滑肌細胞中也有一定的表達，這些殘留細胞能夠通過趨化因子信號適應炎癥引起的微環(huán)境變化[14]。因此，外周血T 細胞表面趨化因子表達變化還可能與肺組織改變有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，重度支氣管哮喘患者CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞上CCR7 陽性表達率低于對照組。CCR7 是CCL19/MIP-3β 和CCL21/SLC 的受體，CCL19/MIP-3β 和CCL21/SLC 及其受體介導T 細胞歸巢至二級淋巴器官[14]。小鼠效應T 細胞提呈CCR7 后，能夠引導T細胞從肺遷移至淋巴管[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，CCR7在哮喘患者氣道平滑肌中表達[16]。因此，在重癥支氣管哮喘患者中，由于CCR7 表達下降，CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞從肺部遷移至外周淋巴器官的能力減弱。

為評估吸入糖皮質(zhì)激素對研究結(jié)果的影響，本研究又根據(jù)吸入糖皮質(zhì)激素劑量對患者進行分層，比較使用不同劑量的哮喘患者間趨化因子受體的表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最高劑量糖皮質(zhì)激素使用患者（＞800 μg/g 的布地奈德）CD3+CD8+和CD3+CD8-T 細胞上僅CXCR1 陽性表達率低于最低劑量組患者，因此，糖皮質(zhì)激素治療僅影響CXCR1 表達。有研究表明布地奈德能夠上調(diào)健康者嗜中性粒細胞CXCR1 和CXCR2 的表達[17]。已有研究表明，注射22 mg 氫化可的松并不影響CD3+T 細胞上CCR7 的表達[18]，因此，本組患者吸入糖皮質(zhì)激素并不影響CCR7 表達。還有研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)2 周每天使用20 mg 潑尼松導致CD4+和CD8+T 細胞上CXCR3 表達降低[19]。本組患者盡管使用吸入糖皮質(zhì)激素，但3 組患者兩種T細胞上CXCR3 表達無差異。

本研究還評估與Th1/Th2 應答有關(guān)的趨化因子受體，即CCR4，CCR8（Th2 應答）和CCR5 和CXCR3（Th1 反應）在T 細胞上的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重度支氣管組CD3+CD8-T 細胞上CCR8 陽性表達率低于對照和輕中度支氣管哮喘組。CCR8 主要表達于激活的Th2 細胞[20]。ZINGONI 等[21]發(fā)現(xiàn)過敏支氣管哮喘患者支氣管活檢標本T 細胞中CCR4 和CCR8 呈陽性表達，與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，輕中度哮喘患者中CD3+CD8-T 細胞上CXCR3、CCR4、CCR5 陽性表達率高于對照組與重度哮喘組。

綜上所述，本研究結(jié)果表明重度支氣管哮喘患者外周血兩種CD3+T 細胞上部分趨化因子受體表達減少，輕、中度哮喘患者中Th1和Th2相關(guān)的趨化因子受體參與免疫應答，而重度支氣管哮喘患者Th1/Th2 應答衰減。