李生花，楊全余，嘎琴，馬蘭，靳國恩

（1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 生理教研室，青海 西寧810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧810001）

高原肺動脈高壓是高原地區(qū)的常見病和高發(fā)病，其病理生理特點為肺動脈壓過度升高和嚴(yán)重的低氧血癥。肺動脈高壓形成包括肺血管持續(xù)性收縮和肺血管重構(gòu)兩種方式，嚴(yán)重時可導(dǎo)致右心肥厚，甚至衰竭。高原肺動脈高壓的發(fā)病機制十分復(fù)雜，且尚未完全闡明，嚴(yán)重影響該病的預(yù)防和治療。2004年在西寧舉辦的第六屆國際高原醫(yī)學(xué)大會和低氧生理學(xué)術(shù)大會暨第五屆中華醫(yī)學(xué)會高原醫(yī)學(xué)年會確定了慢性高原病國際診斷標(biāo)準(zhǔn)——“青海標(biāo)準(zhǔn)”[1]，該標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定高原肺動脈高壓患者平均肺動脈壓應(yīng)≥30 mmHg 或收縮壓≥50 mmHg。高原肺動脈高壓動物模型的成功復(fù)制是研究該病的首要環(huán)節(jié)，復(fù)制是否成功也以其為參考標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有模型復(fù)制方式包括高原現(xiàn)場模型復(fù)制、低壓氧艙模型復(fù)制和化學(xué)缺氧模型復(fù)制3 種。其中，高原現(xiàn)場模型復(fù)制是最理想的方法，除低壓、低氧外，還有寒冷、強紫外線和干燥等因素，能夠真實反映高原綜合環(huán)境對機體的影響，但其費用高，受時間和季節(jié)的限制；與高原現(xiàn)場模型復(fù)制相比，低壓氧艙模型復(fù)制不受時間和季節(jié)限制，費用較低，對環(huán)境因素的可控制性強；化學(xué)缺氧模型復(fù)制不太符合低壓、低氧性高原病的模型特點。許多研究者在選擇高原現(xiàn)場模型復(fù)制或低壓氧艙模型復(fù)制，以及對動物暴露低氧多久時間才能成功復(fù)制等方面存在較大分歧。前者問題的根源在于寒冷對機體生理活動的影響；后者問題的根源在于模型復(fù)制時間差異太大，有低氧暴露20 d 的，有暴露30 d 的，甚至60 d 或更長時間的，這表明大多數(shù)研究者對大鼠高原肺動脈高壓模型復(fù)制成功所需時間是不確定的。本研究比較高原現(xiàn)場模型復(fù)制和低壓氧艙模型復(fù)制所存在的差異，并對大鼠低氧暴露時間、模型復(fù)制海拔與模型復(fù)制成功率的相關(guān)性進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級SD 雄性大鼠。西安380 只，體 重160～200 g，海拔396 m[西安交通大學(xué)動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2017-003]；蘭州100 只，體重160～200 g，海拔1 517 m（蘭州醫(yī)學(xué)院動物所提供）；成都73 只，體重150～180 g，海拔505 m[四川大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2009-09]；北京50 只，體重140～160 g，海拔50 m（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：11400700292756）。

1.1.1 西安的SD 大鼠 根據(jù)模型復(fù)制方式分為高原現(xiàn)場模型復(fù)制（228 只）和低壓氧艙模型復(fù)制（152 只）。其中，高原現(xiàn)場模型復(fù)制在海拔4 300 m、4 500 m 和4 614 m 處進行實驗，每次76 只；3 次實驗根據(jù)低氧暴露時間不同分為第1 天組（15 只）、第3 天組（15 只）、第7 天組（15 只）、第15 天組（15 只）和第30 天組（16 只）5 組。低壓氧艙模型復(fù)制分別在低溫6～12℃和常溫20～22℃進行實驗，每次76 只；2 次實驗根據(jù)低氧暴露時間不同分為第1 天組（15 只）、第3 天組（15 只）、第7 天組（15 只）、第15 天組（15 只）和第30 天組（16 只）5 組。

1.1.2 蘭州的SD 大鼠 根據(jù)模型復(fù)制方式分為高原現(xiàn)場模型復(fù)制（50 只） 和低壓氧艙模型復(fù)制（50 只）。其中，高原現(xiàn)場模型復(fù)制又根據(jù)低氧暴露時間不同又分為低氧第1 天、第3 天、第7 天、第15 天和第30 天5 組，每組10 只。低壓氧艙模型復(fù)制均在20～22℃常溫下進行實驗，根據(jù)低氧暴露時間不同又分為低氧第1 天、第3 天、第7 天、第15 天和第30 天5 組，每組10 只。

1.1.3 成都的SD 大鼠 模型復(fù)制方式為高原現(xiàn)場模型復(fù)制（73 只）。根據(jù)低氧暴露時間不同分為低氧第1 天（18 只）、第3 天（18 只）、第7 天（10 只）、第15 天（10 只）和第30 天（17 只）5 組。

1.1.4 北京的SD 大鼠 模型復(fù)制方式為低壓氧艙模型復(fù)制（40 只），均在20～22℃常溫下進行實驗。根據(jù)低氧暴露時間不同又分為低氧第1 天、第7天、第15 天、第21 天4 組，每組10 只。

1.2 高原現(xiàn)場模型復(fù)制

1.2.1 西安的SD大鼠 海拔4 300 m 地點選在青海省果洛州瑪多縣（低溫8～13℃，室溫）；海拔4 500 m地點選在青海省果洛州瑪多縣花石峽鎮(zhèn)（常溫18～20℃，通過電暖器控制）；海拔4 614 m 地點選在青海省玉樹州曲麻萊縣可可西里不凍泉保護站（低溫6～12℃，室溫）。大鼠室內(nèi)喂養(yǎng)，定期喂水，排除紫外線和干燥的影響。

1.2.2 蘭州和成都的SD 大鼠 現(xiàn)場地點選在青海省果洛州瑪多縣花石峽鎮(zhèn)（常溫18～20℃，通過電暖器控制）。

1.3 低壓氧艙模型復(fù)制

西安、蘭州和北京的SD 大鼠均采用青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心的低壓氧艙（型號DYC-3000，貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司），模擬海拔為5 000 m。西安SD 大鼠常溫實驗室溫保持在20～22℃，低溫實驗將大鼠放置于低壓氧艙中的可調(diào)溫冷藏柜，溫度保持在6～12℃；蘭州和北京的SD 大鼠常溫實驗室溫保持在20～22℃。

1.4 肺動脈壓檢測

于低氧暴露不同時間檢測不同海拔來源大鼠的肺動脈壓：麻醉平穩(wěn)后，分離出右側(cè)頸外靜脈，用肝素化的彎頭聚次亞乙烯管（直徑0.28 μm）沿頸外靜脈插入，直至肺動脈，插管位置利用其典型波形進行確定，壓力換能器終端連接MP150 十六導(dǎo)生理信號采集系統(tǒng)（美國Biopac 公司），通過顯示器觀察波形變化，用AcqKnowledge 3.7.3 軟件進行采集和分析。肺動脈壓數(shù)據(jù)采集完后給予大鼠安樂處死。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間組西安SD 大鼠模型不同海拔不同溫度下的肺動脈壓比較

2.1.1 西安SD 大鼠高原現(xiàn)場模型 相同低氧暴露時間的西安SD 大鼠高原現(xiàn)場模型不同海拔的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。同一海拔不同低氧暴露時間西安SD 大鼠的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著低氧暴露時間的延長，大鼠肺動脈壓逐漸升高；低氧暴露第7 天，部分大鼠的肺動脈壓超過了30 mmHg；低氧暴露第30 天，所有大鼠的肺動脈壓超過30 mmHg，達到了高原肺動脈高壓的模型復(fù)制標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 低氧暴露不同時間組西安SD大鼠不同海拔不同溫度下的肺動脈壓比較 （mmHg，±s）

表1 低氧暴露不同時間組西安SD大鼠不同海拔不同溫度下的肺動脈壓比較 （mmHg，±s）

組別n 4 300 m（8～13℃）4 500 m（18～20℃）4 614 m（6～12℃）F 值P 值第1天組第3天組第7天組第15天組第30天組F 值P 值15 15 15 15 16 20.68±3.30 22.82±2.98 27.60±3.23 32.99±3.79 38.14±4.28 60.846 0.000 20.55±2.97 22.01±3.30 28.55±3.68 34.47±3.62 39.41±4.49 68.122 0.000 20.73±3.37 22.46±2.58 28.59±2.97 33.67±4.49 40.57±3.93 73.059 0.000 0.012 0.264 0.405 0.485 1.228 0.989 0.769 0.670 0.619 0.302

2.1.2 西安SD 大鼠低壓氧艙模型 相同低氧暴露時間的西安SD 大鼠低壓氧艙模型不同溫度下的肺動脈壓比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同低氧暴露時間的西安SD 大鼠同一溫度下的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 低氧暴露不同時間組西安SD大鼠低壓氧艙模型不同溫度下的肺動脈壓比較 （mmHg，±s）

表2 低氧暴露不同時間組西安SD大鼠低壓氧艙模型不同溫度下的肺動脈壓比較 （mmHg，±s）

組別n 20～22℃6～12℃t 值P 值第1天組第3天組第7天組第15天組第30天組F 值P 值15 15 15 15 16 16.74±3.15 22.29±3.77 28.03±3.15 33.51±5.77 38.94±10.37 19.899 0.000 18.45±2.24 21.93±2.92 27.61±2.66 33.33±4.22 38.05±4.42 49.944 0.000 1.753 0.053 0.094 0.006 0.056 0.202 0.823 0.763 0.941 0.815

2.2 相近溫度下不同低氧模型大鼠肺動脈壓的比較

低氧暴露不同時間組西安SD 大鼠高原現(xiàn)場模型4 300 m（8～13℃）、4 614 m（6～12℃）的肺動脈壓數(shù)據(jù)見表1，低氧暴露不同時間組西安SD 大鼠低壓氧艙模型6～12℃下的肺動脈壓數(shù)據(jù)見表2。同樣6～12℃低溫下低氧暴露同一時間組高原現(xiàn)場和低壓氧艙模型大鼠的肺動脈壓比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低氧暴露不同時間組西安SD 大鼠高原現(xiàn)場模型4 300 m（8～13℃）、4 614 m（6～12℃）及低壓氧艙模型5 000 m（6～12℃）的肺動脈壓變化趨勢基本一致（見圖1）。低氧暴露不同時間組西安SD 大鼠高原現(xiàn)場模型4 500 m（18～20℃）的肺動脈壓數(shù)據(jù)見表1，低氧暴露不同時間組西安SD 大鼠低壓氧艙模型20～22℃下的肺動脈壓數(shù)據(jù)見表2。常溫下，低氧暴露同一時間組高原現(xiàn)場和低壓氧艙模型大鼠的肺動脈壓比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低氧暴露不同時間組西安SD 大鼠高原現(xiàn)場模型4 500 m（18～20℃）和低壓氧艙模型5 000 m（20～22℃）的肺動脈壓變化趨勢基本一致（見圖2）。

圖1 低溫下2種復(fù)制模型大鼠的肺動脈高壓變化趨勢

圖2 常溫下2種復(fù)制模型大鼠的肺動脈高壓變化趨勢

2.3 暴露時間對不同海拔來源大鼠模型肺動脈高壓的影響

2.3.1 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠4 500 m高原現(xiàn)場模型的肺動脈壓比較 低氧暴露第1 天、第7 天、第15 天、第30 天的西安、成都、蘭州SD 大鼠的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），相同低氧暴露時間里來源地海拔較低大鼠的肺動脈壓高于來源地海拔較高的大鼠，即西安和成都SD 大鼠的肺動脈壓高于蘭州SD 大鼠，這種差異，隨低氧暴露時間的延長而增大。同一海拔來源大鼠不同低氧暴露時間的肺動脈壓，即西安、成都、蘭州SD 大鼠低氧暴露第1 天、第3 天、第7 天、第15 天、第30 天的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表3）。高原現(xiàn)場模型中，西安、成都、蘭州3 個不同海拔來源大鼠肺動脈壓的總體變化趨勢基本一致，來源地海拔較低大鼠的肺動脈壓高于來源地海拔較高的大鼠（見圖3）。

圖3 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠4 500 m高原現(xiàn)場模型的肺動脈壓變化趨勢

表3 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠4 500 m高原現(xiàn)場模型的肺動脈壓比較 （mmHg，±s）

表3 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠4 500 m高原現(xiàn)場模型的肺動脈壓比較 （mmHg，±s）

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根據(jù)肺動脈壓≥30 mmHg 的要求，低氧暴露第7 天，15 只西安SD 大鼠中有6 只達到要求，模型復(fù)制成功率為40%；10 只成都SD 大鼠中有6 只達到要求，模型復(fù)制成功率為60%；10 只蘭州SD 大鼠中只有2 只達到要求，模型復(fù)制成功率僅為20%。低氧暴露第15 天，15 只西安SD 大鼠中有12 只達到要求，模型復(fù)制成功率為80%；10 只成都SD 大鼠中有8 只達到要求，模型復(fù)制成功率也為80%；10 只蘭州SD 大鼠只有4 只達到要求，模型復(fù)制成功率為40%。低氧暴露第30 天，16 只西安SD 大鼠全部達到要求，模型復(fù)制成功率為100%；17 只成都SD 大鼠也全部達到要求，模型復(fù)制成功率為100%；10 只蘭州SD 大鼠中有8 只達到要求，模型復(fù)制成功率80%。

2.3.2 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠5 000 m 低壓氧艙模型的肺動脈壓比較 低氧暴露第1 天、第7 天、第15 天、第21 天北京、西安、蘭州SD 大鼠的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），西安、蘭州SD 大鼠低氧暴露第30 天的肺動脈壓比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低氧暴露第7 天，來源地海拔最低的北京SD 大鼠的肺動脈壓超過西安和蘭州SD 大鼠，與第1 天比較，北京SD 大鼠的肺動脈壓升高了21.68 mmHg，西安和蘭州SD 大鼠的肺動脈壓分別升高了8.53 mmHg 和4.94 mmHg。低氧暴露第21 天，與第1 天比較，北京SD 大鼠的肺動脈壓升高了29.39 mmHg，西安和蘭州SD 大鼠的肺動脈壓分別升高了18.59 mmHg 和8.62 mmHg。同一海拔來源大鼠不同低氧暴露時間的肺動脈壓，即北京SD 大鼠低氧暴露第1 天、第7 天、第15 天、第21 天的肺動脈壓比較，西安、蘭州SD 大鼠低氧暴露第1 天、第7 天、第15 天、第21 天、第30 天的肺動脈壓比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表4）。低壓氧艙模型中，北京、西安、蘭州3 個不同海拔來源大鼠肺動脈壓的總體變化趨勢基本一致，但不同低氧暴露時間的增幅并不相同，低氧暴露第1 天的大鼠肺動脈壓的結(jié)果顯示，來自海拔越低的大鼠，其初始平均肺動脈壓就越低（見圖4）。

表4 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠5 000 m低壓氧艙模型的肺動脈壓比較 （±s）

表4 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠5 000 m低壓氧艙模型的肺動脈壓比較 （±s）

?

圖4 低氧暴露不同時間組不同海拔來源大鼠5 000 m低壓氧艙模型的肺動脈壓變化趨勢

根據(jù)肺動脈壓≥30 mmHg 的要求，低氧暴露第7天，10 只北京SD 大鼠中有7 只達到要求，模型復(fù)制成功率為70%；10 只西安SD 大鼠中有3 只達到要求，模型復(fù)制成功率為30%；10 只蘭州SD 大鼠中只有1 只達到要求，模型復(fù)制成功率為10%。低氧暴露第21 天，10 只北京SD 大鼠全部達到要求，模型復(fù)制成功率為100%；10 只西安SD 大鼠中有9 只達到要求，模型復(fù)制成功率為90%；10 只蘭州SD大鼠中，只有7 只達到要求，模型復(fù)制成功率為70%。低氧暴露第30 天，10 只西安SD 大鼠全部達到要求，模型復(fù)制成功率為100%；10 只蘭州SD 大鼠中只有8 只達到要求，模型復(fù)制成功率為80%。

2.4 大鼠來源地海拔和模型復(fù)制海拔的海拔落差與肺動脈增幅的相關(guān)性

肺動脈壓升高的趨勢顯示，來源地海拔越低的大鼠，越容易出現(xiàn)肺動脈高壓。對蘭州、西安、北京大鼠來源地海拔和模型復(fù)制時海拔之間的高度落差與肺動脈壓升高幅度（增幅）進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，兩者呈正相關(guān)（r=0.875，P=0.000），即高度落差越大，其肺動脈壓升高幅度就越大。見圖5。

圖5 海拔落差與肺動脈增幅的相關(guān)性

3 討論

高原環(huán)境下除低壓低氧對機體有影響之外，寒冷也是重要的影響因素[2-4]。對低壓氧艙模型復(fù)制（5 000 m）和高原現(xiàn)場模型復(fù)制（4 300～4 614 m）的前期研究進行比較發(fā)現(xiàn)在同一海拔或相近海拔，無論常溫還是低溫，同一來源地大鼠的肺動脈壓增幅效果基本一致，說明寒冷并不參與高原肺動脈高壓的形成機制。有研究報道低壓氧艙模型復(fù)制和高原現(xiàn)場模型復(fù)制指標(biāo)無論從生理學(xué)指標(biāo)、分子生物學(xué)或肺血管平滑肌增厚的形態(tài)學(xué)等方面均獲得一致性結(jié)果[5-7]。這里值得注意的是，大鼠來源地海拔與模型復(fù)制時海拔之間的海拔落差是影響高原肺動脈高壓動物模型復(fù)制的重要因素，本研究結(jié)果表明，就海拔而言，北京、西安、蘭州的大鼠來源地海拔與現(xiàn)場模型復(fù)制或低壓氧艙模型復(fù)制時海拔落差依次降低，而肺動脈壓增幅和模型復(fù)制成功率也依次下降。其中北京大鼠在5 000 m 海拔低壓氧艙復(fù)制模型第21 天即可達到100%的成功率，因此提示，與北京同一海拔或更低海拔的大鼠進行高原肺動脈高壓模型復(fù)制時，只需21 d 即可，無須30 d，避免不必要的時間、經(jīng)濟和精力上的浪費。而與西安同一海拔來源大鼠進行高原肺動脈高壓模型復(fù)制時，仍以30 d 復(fù)制模式為主[8-9]，否則就達不到模型復(fù)制效果，有研究高原型肺動脈高壓時將西安大鼠低氧暴露（6 000 m）21 d，平均肺動脈壓并不能達到模型復(fù)制的要求[10]，但也有研究將模型復(fù)制時間在此基礎(chǔ)上延長15 d，以獲得更好的效果[11]。蘭州的大鼠進行高原肺動脈高壓模型復(fù)制，30 d 模型復(fù)制時間略顯不足，有必要再延長7～14 d。

海拔落差是影響模型復(fù)制成功的核心問題，海拔落差越大，大氣氧含量下降就越顯著，機體需要更強大的代償能力才能獲得足夠滿足機體活動的氧氣，然而機體的代償能力是有限的。因此，一般情況下海拔越高，代償能力不足（或下降）也就越明顯，也就更容易發(fā)生高原病。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，從平原進入海拔3 700 m 和4 200 m 的兩組人，4 200 m組人用力肺活量和6 min 步行實驗顯著下降，而與高原肺動脈高壓形成密切相關(guān)的低氧誘導(dǎo)因子1 和內(nèi)皮素1 顯著升高，這就表明隨著海拔落差的增大，機體的代償能力也隨之降低，海拔落差增大，會促進肺動脈平滑肌增厚的血管內(nèi)皮生長因子上調(diào)[13]。而影響這些因子改變的外在因素是低氧，有研究[14]通過大鼠實驗發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在因素在于平原大鼠對高原的習(xí)服能力，即遺傳補償能力不足。而模型復(fù)制地的海拔，高原現(xiàn)場以4 300 m 以上為宜[15]，低壓氧艙以5 000 m 為宜。

綜上所述，無論是高原現(xiàn)場模型或低壓氧艙模型，模型復(fù)制的成功率與大鼠的來源地海拔和暴露低氧時間密切相關(guān)，在同一海拔進行模型復(fù)制時，大鼠來源地海拔越低，其暴露低氧所需時間就越短，反之就越長。而溫度并不影響高原肺動脈高壓模型的復(fù)制。