余繼全，阮 鵬，葛建軍

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院心臟大血管外科，合肥 230001)

心肌梗死指心肌的缺血性壞死，是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，冠狀動(dòng)脈的血流急劇減少或中斷，冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致血管覆蓋區(qū)域缺血壞死，最終導(dǎo)致多達(dá)10億心肌細(xì)胞的死亡[1]。因?yàn)榈蛲鲂盘?hào)與梗死心臟的修復(fù)和重構(gòu)有關(guān)，因此，靶向凋亡信號(hào)有可能通過減弱梗死心臟的擴(kuò)張性重構(gòu)而發(fā)揮有益的作用[2]。此外，研究結(jié)果表明，凋亡信號(hào)在細(xì)胞保護(hù)和再生中發(fā)揮著巨大作用，再次激發(fā)了人們對(duì)該領(lǐng)域的興趣[3]。川陳皮素是一種碳水化合物，是新陳代謝的硫化促進(jìn)劑，具備一定的抗紅細(xì)胞凝結(jié)的功效，因此，在抗血栓產(chǎn)生層面，其在防癌和抑菌方面具備抗敏和抗炎的作用，常被用于治療癲癇病和過敏等病癥[4]。有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川陳皮素在防止心血管疾病層面也有一定的作用，如其對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有治療作用[5]。Rnd3最初被定義為Rho蛋白激酶1的抑制因子[6]。此前對(duì)Rnd3的研究主要集中于Rho激酶介導(dǎo)的生物學(xué)功能的抑制作用，包括肌球蛋白輕鏈磷酸化、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架形成和凋亡等[7]。Rnd3與室管膜細(xì)胞增殖相關(guān)[8]。然而，其在心肌梗死凋亡中的作用尚不清楚。核因子κB(NF-κB)P65復(fù)合物在發(fā)育和成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，并且激活細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡[9]。雖然NF-κB參與了神經(jīng)元凋亡率的降低，但其在心肌梗死中的潛在分子機(jī)制和功能尚不清楚。由于Rnd3和NF-κB都與細(xì)胞凋亡過程息息相關(guān)，探索兩者在心肌細(xì)胞凋亡過程中的作用對(duì)于心肌梗死的治療具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重約為25 g；8周齡雌性妊娠SD大鼠，體重約為280 g。購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)期間給予常規(guī)飲水、喂食。本研究通過我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.2 儀器

311型細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇杰瑞爾電器有限公司)；CJV1500-Y標(biāo)準(zhǔn)型潔凈工作臺(tái)(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；Universal 320/320R型低溫離心機(jī)(美國Sigma公司)；SX-300型高壓蒸汽滅菌鍋(日本Tomy Digital Biology公司)；小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；Sigma Vet小鼠心臟超聲系統(tǒng)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；Axio Vert.A1倒置光學(xué)顯微鏡(德國Zeiss公司)。

1.3 藥品與試劑

川陳皮素(西安展迅生物科技有限公司)；Protein A瓊脂糖珠(美國Sigma公司)；Rnd3抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；Caspase3抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；GAPDH抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；P65抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；免疫球蛋白G(IgG)抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(美國Jackson公司)；NF-κB激動(dòng)劑(美國Selleck公司)；抑制Rnd3慢病毒(Sh-Rnd3)和過表達(dá)Rnd3慢病毒(OE-Rnd3)及對(duì)照[漢恒生物科技(上海)有限公司]；Sh-Rnd3 AAV9病毒及對(duì)照[漢恒生物科技(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 小鼠心肌梗死模型

根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]對(duì)小鼠進(jìn)行心肌梗死造模。以3%戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛發(fā)(充分暴露手術(shù)區(qū))，以碘酒和75%乙醇進(jìn)行手術(shù)區(qū)消毒。麻醉后，打開外置光源、顯微鏡開關(guān)，打開呼吸機(jī)，設(shè)置好各參數(shù)(呼吸頻率為110 次/min)，將氣管插管沿聲門插入氣管，取下小鼠接上呼吸機(jī)。小鼠采用右側(cè)臥位，用眼科剪在左前肢腋下，用顯微剪于三、四肋間打開胸腔充分暴露心臟，用顯微直鑷輕輕夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包，充分暴露左冠狀動(dòng)脈前降支或所在區(qū)域。于顯微鏡下找到左冠狀動(dòng)脈前降支走向或可能所在位置，持針器持取7-0帶針縫合線，于左心耳下緣2 mm處進(jìn)針，縫線穿過左冠狀動(dòng)脈前降支，以完全阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支血流。結(jié)扎完成后，以6-0縫線完全縫合胸腔開口，關(guān)閉胸腔，由內(nèi)向外逐層縫合各層肌肉和皮膚。待小鼠自然蘇醒后，將小鼠從呼吸機(jī)上取下并取下氣管插管，正常飼養(yǎng)。4周后進(jìn)行心臟超聲檢測。

2.2 動(dòng)物分組及處理

2.2.1 普通正常小鼠實(shí)驗(yàn)：取普通正常小鼠40只，隨機(jī)分為四組，每組10只。假手術(shù)組為普通正常小鼠打開胸腔后立即縫合不進(jìn)行結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；心肌梗死手術(shù)組為普通正常小鼠打開胸腔后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支然后進(jìn)行縫合；川陳皮素灌胃組為普通正常小鼠灌胃20 mg/kg川陳皮素[2]；川陳皮素灌胃+心肌梗死手術(shù)組為普通正常小鼠先灌胃20 mg/kg川陳皮素，3周后對(duì)小鼠進(jìn)行心肌梗死手術(shù)。4周后處死上述小鼠結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 心肌梗死小鼠實(shí)驗(yàn)：取模型小鼠(心肌梗死手術(shù))40只，并隨機(jī)分為四組，每組10只。造模組為普通小鼠進(jìn)行心肌梗死手術(shù)；造模+川陳皮素組為模型小鼠灌胃川陳皮素20 mg/kg；造模+NF-κB激動(dòng)劑組為模型小鼠心肌層注射NF-κB激動(dòng)劑100 nmol/L；造模+川陳皮素+NF-κB激動(dòng)劑組：模型小鼠灌胃20 mg/kg川陳皮素和心肌層注射NF-κB 激動(dòng)劑100 nmol/L。4周后處死以上小鼠結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.3 小鼠心肌層注射

將小鼠放在手術(shù)臺(tái)上固定好，使用4%水合氯醛麻醉后，退去小鼠頸部和左胸口的毛發(fā)，并用75%酒精消毒，使用手術(shù)剪在小鼠左胸口橫向剪開一約1 cm長的開口，暴露出心臟。使用微量注射器按三點(diǎn)注射的方式注射NF-κB激動(dòng)劑100 nmol/L進(jìn)左心室室壁，對(duì)照組小鼠注射等量PBS。注射結(jié)束后立刻縫合肌肉和皮膚，并對(duì)傷口進(jìn)行消毒。待小鼠完全蘇醒后將其放回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)。

2.4 大鼠心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.4.1 分離新生大鼠心肌細(xì)胞(NRCM)：取SD大鼠新生小鼠心臟，將殘存血液擠凈后放入緩沖液中，用剪刀將心臟組織剪成勻漿狀，按照1只心臟加入胰酶和膠原酶各500 μL依次消化，加入等量的馬血清進(jìn)行終止，將得到的細(xì)胞懸液依次通過一次性過濾網(wǎng)篩選，去除雜質(zhì)，采用差速貼壁法得到純的心肌細(xì)胞，棄除未貼壁的成纖維細(xì)胞。按照所需細(xì)胞密度進(jìn)行鋪板實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 蛋白免疫共沉淀：收集細(xì)胞入1.5 mL EP管中，4 ℃，14 000 r/min離心15 min并用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每1 mL總蛋白中加入Protein A瓊脂糖珠(50%)100 μL，4 ℃搖晃10 min，以去除非特異性雜蛋白，降低背景。4 ℃，14 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子。Bradford法做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度。用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μL。加入一定體積的兔抗到500 μL總蛋白中，4 ℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜。加入Protein A瓊脂糖珠100 μL來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4 ℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜。14 000 r/min瞬時(shí)離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清液，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，每遍800 μL。用60 μL 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，上樣前樣品煮5 min后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)。

2.4.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒：慢病毒轉(zhuǎn)染前24 h，將貼壁細(xì)胞以1×105/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×105/孔左右。第2日，用含有6 μg/mL polybrene的新鮮培養(yǎng)基2 mL替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37 ℃孵育。4 h后加入新鮮培養(yǎng)基2 mL以稀釋polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，72 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

2.4.4 染色質(zhì)免疫共沉淀：首先使用3%的甲醛交聯(lián)細(xì)胞10 min，然后加入Glycine 1.5 mmol/L終止交聯(lián)反應(yīng)。依次使用細(xì)胞裂解液和核裂解液各1 mL裂解細(xì)胞膜和細(xì)胞核，使用200 Hz的超聲將細(xì)胞核中的DNA片段剪切到250 bp左右。將超聲后的DNA片段離心后取上清液，與5 μg抗體孵育過夜，對(duì)應(yīng)種屬的IgG作為陰性對(duì)照。提取DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)

配制10%的SDS-PAGE濃縮膠和分離膠。加入1 mL蛋白裂解液入含有組織塊的EP管中以裂解組織提取蛋白，采用BCA法測定定量蛋白濃度，濃縮膠中每孔加入蛋白樣品20 ng/μL，濃縮膠用80 V電壓進(jìn)行電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后，改用120 V進(jìn)行電泳。跑膠完成以后，將膠上無樣品的多余部分切除，潤濕濾紙和海綿，提前10 min用轉(zhuǎn)膜 Buffer潤洗PVDF膜。分離的多肽轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%的脫脂牛奶室溫(25 ℃)封閉2 h。一抗孵育過夜，Caspase3(1∶1 000)，Rnd3(1∶1 000)，GAPDH(1∶1 000)。次日，用TBST洗膜3次，1次10 min。室溫下用二抗孵育2 h。用TBST洗膜3次，1次10 min。用ECL顯影液進(jìn)行顯影曝光。

2.6 Tunel染色

將冰凍切片從-80 ℃冰箱中取出并在室溫復(fù)溫5 min，用PBS輕柔漂洗3次，1次5 min。用4%多聚甲醛室溫固定15 min，用Proteinase K工作液在37 ℃中處理組織15 min，用PBS輕柔漂洗3次，1次5 min，每塊組織覆蓋50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP混合液，于37 ℃濕暗盒中反應(yīng)30 min，用PBS輕柔漂洗3次，1次5 min。用DAPI避光處理15 min，用PBS輕柔漂洗3次，1次5 min。使用熒光顯微鏡進(jìn)行拍攝統(tǒng)計(jì)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 川陳皮素抑制心肌梗死小鼠心臟組織中Rnd3和凋亡蛋白的表達(dá)

心臟超聲結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死手術(shù)組小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率明顯降低；與心肌梗死手術(shù)組相比，川陳皮素灌胃+心肌梗死手術(shù)組小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率明顯升高，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(A)。蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，心肌梗死手術(shù)組小鼠心臟組織中Rnd3和Cleaved-caspase3的含量顯著升高；與心肌梗死手術(shù)組相比，川陳皮素灌胃+心肌梗死手術(shù)組小鼠心臟組織中Rnd3和Cleaved-caspase3的含量顯著降低，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1(B)。

A.川陳皮素對(duì)小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率的影響；B.川陳皮素對(duì)小鼠心臟組織凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Rnd3表達(dá)的影響；“*”表示P<0.05

3.2 Rnd3通過結(jié)合NF-κB P65調(diào)控心肌梗死

應(yīng)用蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Rnd3和P65的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，與IgG組相比，Rnd3蛋白和P65蛋白存在結(jié)合，見圖2(A)；應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Rnd3和P65的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，與IgG組相比，Rnd3 mRNA和P65 mRNA存在結(jié)合，見圖2(B)；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)檢測NRCM細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sh-Rnd3，P65蛋白表達(dá)升高，見圖2(C)；應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)檢測NRCM細(xì)胞中轉(zhuǎn)染OE-Rnd3，P65蛋白表達(dá)降低，見圖2(D)。

A.Rnd3與NF-κB P65蛋白的結(jié)合情況；B.Rnd3與P65 mRNA的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況；C.轉(zhuǎn)染Sh-Rnd3，P65蛋白表達(dá)情況；D.轉(zhuǎn)染OE-Rnd3，P65蛋白表達(dá)情況；“*”表示P<0.05

3.3 川陳皮素激活NF-κB信號(hào)通路保護(hù)心肌梗死導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡

心臟超聲結(jié)果顯示，與造模組相比，造模+川陳皮素組、造模+NF-κB激動(dòng)劑組和造模+川陳皮素+NF-κB激動(dòng)劑組小鼠心臟射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但川陳皮素、NF-κB激動(dòng)劑同時(shí)給藥不存在疊加效應(yīng)，見圖3(A)。蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與造模組相比，造模+川陳皮素組、造模+NF-κB激動(dòng)劑組和造模+川陳皮素+NF-κB激動(dòng)劑組小鼠Cleaved-caspase3表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，川陳皮素、NF-κB激動(dòng)劑同時(shí)給藥存在疊加效應(yīng)，見圖3(B)。Tunel染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與造模組相比，造模+川陳皮素組、造模+NF-κB激動(dòng)劑組和造模+川陳皮素+NF-κB激動(dòng)劑組小鼠細(xì)胞凋亡減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者同時(shí)給藥存在疊加效應(yīng)，見圖3(C)。

4 討論

心肌梗死指在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，如發(fā)生冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，脂性斑塊發(fā)生脫落，進(jìn)而堵塞相應(yīng)部分的冠狀動(dòng)脈，發(fā)生冠狀動(dòng)脈供血急劇減少或者中斷，進(jìn)而使冠狀動(dòng)脈供應(yīng)部位的心肌發(fā)生急性和持久性的缺血，進(jìn)一步會(huì)導(dǎo)致心肌壞死[10]。心肌梗死往往會(huì)表現(xiàn)為持久的胸骨后劇烈疼痛、發(fā)熱、白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高以及血清標(biāo)志物水平升高，尤其是心肌壞死標(biāo)志物的增加[11]。心肌梗死還可誘發(fā)一系列心律失常和休克等[12]。近年來，隨著心肌梗死患病人數(shù)的急劇增長，越來越多的研究聚焦于心肌梗死的防治手段。目前，臨床上常采用抗炎、降脂、鎮(zhèn)痛的藥物和再灌注進(jìn)行治療，但適用性和治療效果有一定局限性[13]。此外，缺血再灌注治療會(huì)使遭受一定時(shí)間缺血的組織細(xì)胞恢復(fù)血流后引起組織損傷程度迅速加劇的現(xiàn)象，對(duì)患者造成二次損傷[14]。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌梗死發(fā)生發(fā)展過程中心肌收縮單元持續(xù)喪失的主要原因，與心功能進(jìn)行性降低有關(guān)，參與心肌梗死的基本病理生理過程[15]。抑制心肌缺血后心肌細(xì)胞凋亡，增加心肌細(xì)胞存活數(shù)量，有利于預(yù)防和治療心肌缺血，還可促進(jìn)心功能恢復(fù)，有利于患者的長期預(yù)后。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)減少心臟重構(gòu)、改善心功能具有重要的臨床意義。

心肌梗死過程涉及多條信號(hào)通路的調(diào)控，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是防止心肌缺血再灌注損傷的重要通路，缺血性預(yù)處理或活性藥物刺激可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，該信號(hào)通路的激活參與調(diào)控心肌細(xì)胞增殖和凋亡，且可促進(jìn)心肌梗死后的血管生成，保護(hù)心臟[16-17]。NF-κB是生物體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，抑制NF-κB可以減輕炎癥反應(yīng)，激活NF-κB可促進(jìn)血管形成和遷移，且NF-κB的表達(dá)水平可作為預(yù)測急性心肌梗死患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)[18-19]。

川陳皮素作為抗血栓藥，在疏通血管、抑制血小板聚集方面可發(fā)揮重要作用[20]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，Rnd3可通過RhoA-ROCK1和ERK1/2信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖和遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死小鼠心臟組織中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)明顯升高，表明心肌梗死過程中確實(shí)凋亡作用增強(qiáng)；且心肌細(xì)胞中Rnd3表達(dá)升高，但在灌胃川陳皮素治療后，凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Rnd3表達(dá)顯著降低；同時(shí)，Tunel染色發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞數(shù)目也減少，進(jìn)一步證實(shí)川陳皮素可以通過下調(diào)Rnd3水平抑制心肌梗死導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，其對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用。

抑制Rnd3/NF-κB通路可減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷。Rnd3為Ras超家族的重要成員，為NF-κB通路相關(guān)的負(fù)調(diào)控因子，Rnd3蛋白可下調(diào)p65蛋白表達(dá)，降低TNF-α和IL-6水平，從而減輕肝臟缺血/再灌注損傷[22]。本研究結(jié)果顯示，Rnd3通過與NF-κB P65結(jié)合抑制心肌梗死細(xì)胞凋亡，對(duì)急性心肌梗死有保護(hù)作用。

綜上所述，川陳皮素/Rnd3/NF-κB P65通路可能為心肌梗死的機(jī)制提供新的認(rèn)識(shí)。