蓋祥云，趙恩麒，王金宇，趙悅孚，何彥峰，林鵬程

(青海民族大學(xué)1. 藥學(xué)院、2. 青海省青藏高原植物化學(xué)重點實驗室，青海 西寧 810007)

慢性缺氧性肺疾病(支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化和限制性胸壁異常等)，是世界上最常見的致殘和死亡原因之一，低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是導(dǎo)致肺部血管阻力升高的主要機制[1]。HPH的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷了急性期的低氧性肺血管收縮(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)以及慢性期的低氧性肺血管重塑(hypoxic pulmonary vascular remodeling，HPVR)[2]。HPH通常早期難以發(fā)現(xiàn)，直到后期出現(xiàn)心力衰竭，如呼吸困難、心悸和下肢水腫等癥狀才會被診斷治療[3]。該疾病的發(fā)病機制復(fù)雜，目前的研究尚未能完全解釋其發(fā)生發(fā)展機制。以往研究發(fā)現(xiàn)：肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)內(nèi)游離鈣離子濃度(cytoplasmic free Ca2+concentration，[Ca2+]i)異常升高是肺血管持續(xù)收縮和重塑導(dǎo)致肺動脈高壓發(fā)生的主要誘因[4-5]。低氧條件下，諸多調(diào)節(jié)途徑參與誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+水平的升高，繼而引發(fā)細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡。一方面，作為PASMCs內(nèi)最重要和最根本的第二信使，Ca2+不僅參與了HPV的形成和發(fā)展過程，也能夠通過調(diào)節(jié)PASMCs的遷徙與增殖，促進HPVR的形成[6-7]；另一方面，鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在維持肺動脈內(nèi)皮細胞屏障完整性以及肺動脈內(nèi)皮細胞釋放舒血管物質(zhì)等過程中都發(fā)揮了重要作用[3]。

本文著眼于低氧導(dǎo)致PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡的作用機制，就近年來的相關(guān)研究做一綜述。全文共分為3個主要部分：低氧與PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡；鈣穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)HPV的機制；鈣穩(wěn)態(tài)失衡在HPVR中的作用。

1 低氧與PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡

1.1 低氧-缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)-PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡低氧可誘導(dǎo)PASMCs中HIF-1的聚集。HIF-1由α和β亞基構(gòu)成。HIF-lα是氧調(diào)節(jié)蛋白，為HIF-1的特有組份，而HIF-1β是多種轉(zhuǎn)錄因子的共同亞基。常氧下，胞質(zhì)中HIF-1α易降解。相反，缺氧時HIF-1α的降解受到抑制。HIF-1α在胞質(zhì)中聚積，并與HIF-1β形成穩(wěn)定的異二聚體。HIF-1聚積，使編碼鈣庫操縱性鈣通道和受體操縱性鈣通道的經(jīng)典瞬時受體電位通道1(transient receptor potential canonical 1，TRPC1)和經(jīng)典瞬時受體電位通道6(transient receptor potential canonical 6，TRPC6)表達水平上調(diào)，誘導(dǎo)鈣內(nèi)流，胞內(nèi)游離鈣水平升高，最終促進HPV和HPVR的發(fā)生[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，敲除HIF-1α的大鼠，發(fā)生肺動脈高壓的幾率顯著下降，肺動脈重構(gòu)明顯改善[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下，敲除HIF-1α能夠下調(diào)PASMCs中的TRPC1和TRPC6通道的表達和功能[10]。慢性低氧條件下，白楊素能夠通過下調(diào)PASMCs中HIF-1α、TRPC1和TRPC6的表達來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度，從而發(fā)揮改善肺動脈高壓的作用[11]。

1.2 低氧-K+通道-PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡低氧條件下，PASMCs上的電壓依賴性K+通道失活，K+外流受限制，細胞膜發(fā)生去極化，進而使得電壓依賴性鈣通道開放，[Ca2+]i增加。Ca2+通過與肌質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜上的鈣通道蛋白蘭尼堿受體(ryanodine receptors，RyR)結(jié)合，進一步誘導(dǎo)肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣釋放，觸發(fā)細胞興奮收縮耦聯(lián)機制，導(dǎo)致平滑肌收縮，從而促進HPV[6]。Hua等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果多酚能夠通過影響K+通道活性，減少PASMCs胞質(zhì)內(nèi)的游離鈣濃度，從而逆轉(zhuǎn)肺血管收縮[12]。

1.3 低氧-鈣庫操縱性鈣通道(store-operated calcium channel, SOC)-PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡SOC可調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)/肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)鈣庫耗竭而引發(fā)的[Ca2+]i升高，稱為鈣庫操縱性鈣內(nèi)流。另外，鈣庫耗竭，SOC可誘導(dǎo)鈣庫的重新充盈。目前的研究發(fā)現(xiàn)在PASMCs中，調(diào)控Ca2+參與低氧反應(yīng)的主要是SOC中的TRPC1和TRPC6，另外也有研究表明Orai 1蛋白也參與其中[13]。

基質(zhì)交感分子1 (stromal interaction molecule，STIM1)主要參與調(diào)控鈣庫操縱性鈣內(nèi)流。在正常狀態(tài)下，STIM1作為一種單通道跨膜蛋白定位于ER/SR膜，當(dāng)ER/SR的內(nèi)鈣耗竭時，STIM1離開ER/SR膜，轉(zhuǎn)運至細胞膜，與Orai 1通道形成鈣釋放激活鈣通道(Ca2+release-activated Ca2+current，CRAC)，它對鈣高度敏感，能夠促進外鈣內(nèi)流。隨著細胞內(nèi)鈣庫再次充盈，STIM1失活，鈣內(nèi)流減少[14]。

在眾多的通路中，低氧通過SOC誘導(dǎo)鈣庫操縱性鈣內(nèi)流增加是PASMCs的[Ca2+]i升高的重要機制之一。研究表明：低氧處理，能夠使得PASMCs表面的SOC表達增加，繼而通過SOC的外鈣內(nèi)流增加[15]。另外，低氧條件下，人肺動脈內(nèi)皮細胞中經(jīng)典瞬時受體電位通道4轉(zhuǎn)錄水平升高，使得SOC表達增加、功能上調(diào)，細胞內(nèi)鈣水平升高，進一步使激活蛋白1活性及表達均增加。同時，血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)及血小板衍生生長因子等應(yīng)答基因的表達水平升高，最終誘導(dǎo)肺動脈內(nèi)皮細胞的生長因子增加，從而促進PASMCs的增殖，導(dǎo)致肺動脈重構(gòu)[16]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)西地那非能夠通過下調(diào)TRPC1的表達，抑制PASMCs的鈣庫操縱性鈣內(nèi)流，從而改善缺氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖[17]。

1.4 低氧-受體操縱性鈣通道(receptor-operated calcium channel，ROC)-PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡目前的研究表明：ROC定位于細胞膜上，在PASMCs中，ROC由經(jīng)典瞬時受體電位通道3、TRPC6、經(jīng)典瞬時受體電位通道7參與構(gòu)成。低氧條件下，ET-1、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、血管緊張素Ⅱ、血小板生長因子等血管活性物質(zhì)與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，激活磷脂酶C(phospholipase，PLC)，PLC能夠進一步催化二磷酸磷脂酰肌醇裂解成三磷酸肌醇(inositol 1, 4, 5-triphosphate，IP3)、二?；视?diacylglycerol，DAG)。IP3與SR或ER膜上的IP3受體(IP3 receptor，IP3R)結(jié)合，導(dǎo)致Ca2+從SR/ER釋放或動員進入細胞質(zhì)，[Ca2+]i升高；DAG能夠誘發(fā)ROC的開放，DAG作為第二信使，能夠直接激活ROC，[Ca2+]i升高[14]。研究表明：U73122作為PLC抑制劑，能夠減少DAG的生物合成，從而減弱野生型小鼠HPV；另外，使用OAG(DAG類似物)激活TRPC6或者減少DAG的降解，都能夠引發(fā)小鼠發(fā)生肺動脈收縮[18]。Kaymak等[19]研究表明，在低氧誘導(dǎo)的實驗性肺動脈高壓大鼠中，氯喹能夠降低肺動脈中TRPC1、TRPC6和鈣敏感受體的表達，從而改善肺動脈重構(gòu)。

1.5 低氧-鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，GaSR)-PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡Ca2+作為第二信使在HPV和HPVR中發(fā)揮重要作用的同時，又是其中關(guān)鍵的第一信使。低氧處理后，細胞外鈣能夠通過激活細胞膜上的GaSR，進一步激活PLC-IP3-Ca2+途徑，IP3與PASMCs內(nèi)鈣庫上的IP3受體結(jié)合，進一步引發(fā)內(nèi)鈣釋放，胞內(nèi)的第二信使Ca2+水平升高。

CaSR是一種G蛋白偶聯(lián)受體，能夠感知細胞外鈣濃度的變化，參與到鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中[20]。目前的研究發(fā)現(xiàn)：CaSR在血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞中均有表達[21]，它能夠被氨基酸(苯丙氨酸和谷氨酸)、多價陽離子(Ca2+，Gd3+，Mg2+)以及氨基糖苷類抗生素等激活。Yamamura等[22]的研究表明：在低氧導(dǎo)致的肺動脈高壓小鼠和野百合堿引發(fā)的肺動脈高壓大鼠中，PASMCs的CaSR表達水平均升高；利用NPS2143阻斷鈣敏感受體后，HPH動物的右心室收縮壓、右心肥大指數(shù)均顯著降低，并且肺小動脈的重構(gòu)得到明顯改善。

1.6 低氧-低氧誘導(dǎo)促有絲分裂因子(hypoxia-induced mitogenic facto，HIMF)-PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡HIMF具有促有絲分裂、血管生成、血管收縮和趨化因子樣的特性，這些特性都與病理性肺疾病(血管收縮、血管重塑、炎癥和纖維化)有關(guān)。2009年,Fan等[23]發(fā)現(xiàn)HIMF能夠通過激活PLC-IP3途徑，引發(fā)人PASMCs內(nèi)鈣水平升高，導(dǎo)致肺血管收縮，最終引發(fā)肺動脈高壓。HIMF為PASMCs外CaSR的非經(jīng)典配體，低氧刺激下HIMF與CaSR結(jié)合能夠引發(fā)PASMCs增殖和HPH的發(fā)生[24]。最新的研究證明，在HIMF誘導(dǎo)肺動脈高壓形成中，高遷移率族蛋白B1-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在“肺動脈平滑肌細胞-內(nèi)皮細胞”相互調(diào)控的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。

低氧導(dǎo)致PASMCs的[Ca2+]i升高的可能機制(Fig 1)有待進一步的研究和完善，隨著今后研究的深入，會發(fā)現(xiàn)更多的調(diào)控通路和潛在的藥物靶點。

Fig 1 Mechanism of hypoxic-induced increase of intracellular free calcium concentration in PASMCs

2 HPV與PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡

HPV是指低氧刺激下，眾多因素導(dǎo)致的強烈的肺動脈收縮。低氧下，HPV這一特殊的反應(yīng)是機體為了維持肺組織正常的通氣/血流比值所產(chǎn)生的適應(yīng)機制，但是隨著低氧的持續(xù)發(fā)生，這一反應(yīng)也會變成引發(fā)肺動脈高壓的病理因素[1]。低氧條件下，HPV發(fā)生發(fā)展的一項重要誘因就是“低氧導(dǎo)致的PASMCs內(nèi)鈣水平升高”[26]。

如前所述，低氧能夠通過諸多途徑引發(fā)PASMCs內(nèi)游離鈣水平升高，細胞內(nèi)鈣離子進一步與鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合物，激活肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶，引發(fā)肌球蛋白輕鏈磷酸化，進一步激活肌動蛋白-肌球蛋白收縮裝置，導(dǎo)致PASMCs發(fā)生收縮，引發(fā)HPV。

3 HPVR與PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡

HPVR是指PASMCs增殖、細胞外基質(zhì)增加等導(dǎo)致的動脈管壁增厚及肺小動脈管腔狹窄。目前，針對HPH中HPVR的治療方法有限，肺血管重塑的重要驅(qū)動因素之一就是PASMCs的過度增殖和凋亡抵抗[27]。降低PASMCs內(nèi)[Ca2+]i可以有效地抑制或者改善HPVR，使得肺動脈壓力降低[7]。

3.1 [Ca2+]i升高-PI3K/Akt/mTOR-PASMCs增殖Akt又被稱為蛋白激酶B，是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)下游的作用位點之一。作為與PI3K/Akt通路密切關(guān)聯(lián)的蛋白激酶之一，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可作為Akt下游的一個底物被激活。

PI3K/Akt/mTOR可參與細胞凋亡、細胞增殖、細胞自噬等多個環(huán)節(jié)。Lee等[28]證實，低氧可以激活雞肝細胞Ca2+/PI3K/Akt/mTOR通路，調(diào)節(jié)細胞周期蛋白，促進雞肝細胞DNA合成，從而誘導(dǎo)細胞增殖。PASMCs內(nèi)游離鈣水平升高，可激活PI3K/Akt/mTOR，使得細胞周期蛋白表達增加，最終誘導(dǎo)PASMCs的增殖[23]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓小鼠模型中，低氧誘導(dǎo)HIMF表達增加，誘導(dǎo)Akt磷酸化，能夠促進PASMCs增殖[29]。

3.2 [Ca2+]i升高-PKC/MAPKs-PASMCs增殖蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)由Ca2+激活，調(diào)節(jié)細胞凋亡及生長分化等過程。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，包括p44/42MAPK、p38MAPK(α、β)、Jun N端激酶等，可被多種細胞外信號激活。MAPK被活化，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，能夠調(diào)節(jié)細胞周期蛋白。缺氧能夠通過誘導(dǎo)雞肝細胞[Ca2+]i升高，激活PKC/MAPKs，進一步促進DNA合成，誘導(dǎo)細胞發(fā)生異常增殖[28]。目前的研究表明：缺氧通過誘導(dǎo)大鼠PASMCs的HIMF表達水平上調(diào)，進一步引發(fā)細胞內(nèi)Ca2+水平升高，通過調(diào)控PASMCs中PKC/MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)細胞異常增殖[30]。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，低氧導(dǎo)致PASMCs鈣穩(wěn)態(tài)失衡過程中，HIF-1α、TRPC1、TRPC6、部分敏感的K+通道、PLC、CaSR、HIMF及ROC相關(guān)的膜受體都有可能成為HPH防治藥物的潛在靶點或者干預(yù)目標。

目前為止，雖然越來越多的研究者關(guān)注Ca2+在HPH發(fā)生發(fā)展過程中扮演的角色，但是仍然存在著很多不明確的問題。首先，低氧誘導(dǎo)PASMCs發(fā)生鈣穩(wěn)態(tài)失衡的相關(guān)機制并不是單獨存在的幾條通路，而是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機制，目前的研究并不能完全、清楚地闡述這個網(wǎng)絡(luò)機制；第二，鈣超載引發(fā)HPV和HPVR還涉及哪些因素和信號通路，也有待研究；第三，低氧后，PASMCs鈣超載與肺動脈內(nèi)皮細胞的損傷有哪些聯(lián)系，也需要進一步研究和解釋。