譚雪梅，許麗娜，彭金詠，尹連紅

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116044)

抑郁癥是當(dāng)今世界最嚴(yán)重的精神疾病之一，也是初級(jí)衛(wèi)生保健中最常見的精神疾病，其特點(diǎn)之一就是顯著持久的心情壓抑、情緒低落。據(jù)世界衛(wèi)生組織相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，目前全球抑郁癥患者高達(dá)4.8%，并且患病人數(shù)還在不斷上升。已有文獻(xiàn)證明，心血管疾病、二型糖尿病、乳腺癌、帕金森病、焦慮癥等疾病的發(fā)生都伴隨著抑郁癥的產(chǎn)生[1-3]。因此，深入研究抑郁癥的發(fā)病機(jī)制及治療對(duì)策是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

氧化應(yīng)激通過自由基、非自由基分子、活性氧等多種物質(zhì)參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[4]。抑郁癥常伴有氧化應(yīng)激失調(diào)，如總抗氧化能力異常、氧化損傷和自身免疫反應(yīng)產(chǎn)物等[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者皮質(zhì)線粒體能量產(chǎn)生減少，葡萄糖類似物攝取減少，提示抑郁癥的發(fā)生與能量缺陷和糖代謝異常密切相關(guān)[6]。解偶聯(lián)蛋白家族新成員-解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)普遍存在于心臟、大腦等多種組織中，可通過抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7]。UCP2是一種線粒體負(fù)離子載體蛋白，具有調(diào)節(jié)能量代謝的作用[8]。因此，UCP2有可能是一個(gè)有效預(yù)防和治療抑郁癥的藥物作用靶點(diǎn)。

目前，臨床上常用的抗抑郁癥藥物均能增加突觸間單胺類神經(jīng)遞質(zhì)作用，如丙咪嗪、氟西汀等。但是，這些藥物或多或少存在一些不良反應(yīng)，并且部分重性抑郁癥患者在一定劑量和時(shí)間內(nèi)對(duì)抗抑郁癥藥物沒有反應(yīng)。因此，尋找起效快、副作用小的抗抑郁癥活性先導(dǎo)物是非常必需的。薯蕷皂苷(dioscin，DIO)是一種天然甾體皂苷類化合物，存在于穿龍薯蕷、山藥等多種藥用植物中。近年來研究表明，薯蕷皂苷通過調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等保護(hù)器官損傷，對(duì)糖尿病、肥胖等代謝性疾病也有調(diào)節(jié)作用[9-10]。但是，目前未見薯蕷皂苷抗抑郁作用的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過構(gòu)建慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)小鼠抑郁模型來探討薯蕷皂苷抗抑郁的藥理學(xué)作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ SPF級(jí)C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量(20±2)g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與護(hù)理?xiàng)l例進(jìn)行，經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑薯蕷皂苷純度≥98%(實(shí)驗(yàn)室自制)；氟西汀(fluoxetine, FLU)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：D1823052)；皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)(批號(hào)：201903)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)(批號(hào)：201904)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamin, 5-HT)(批號(hào)：201903)ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)(批號(hào)：20190616)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)(批號(hào)：20190713)和過氧化氫酶(catalase, CAT)(批號(hào)：20190612)試劑盒(南京建成生物技術(shù)公司)；組織蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20180906)；一抗UCP2、GLUT1、G6Pase、Nrf2、SOD2及二抗(HRP-GOAT anti-Rabbit)(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；一抗β-actin(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置、懸尾實(shí)驗(yàn)裝置(上海欣軟信息科技有限公司)；PMOD 3.4軟件(PMOD Technology，Switzerland)；酶標(biāo)儀(Thermo，USA)；U-3010紫外可見分光光度計(jì)(HITACHI，Japan)；TE2000-U顯微鏡(Nikon, Japan)；DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀(北京市六一儀器廠)；UVP凝膠成像系統(tǒng)(BioSpectrum系列，USA)。

2 方法

2.1 造模CUMS法造模參照文獻(xiàn)方法[11]并根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行改良：禁食24 h、禁水24 h、晝夜顛倒24 h、潮濕墊料24 h(100 g墊料加200 mL水)、抽離墊料24 h、鼠籠45°傾斜24 h、水平振蕩5 min、冰水浴4 ℃游泳5 min、溫水浴45 ℃游泳5 min、夾尾1 min、束縛(50 mL 塑料離心管中)2 h。每周隨機(jī)選擇7種刺激方式，同一種刺激不得連續(xù)出現(xiàn)，連續(xù)造模4周。正常組(Control)和DIO對(duì)照組(DIO Control)常規(guī)飼養(yǎng)，不給予任何刺激。

2.2 分組與給藥將造模成功的小鼠隨機(jī)均分為模型(Model)組、薯蕷皂苷低、中、高劑量組(20、40、80 mg·kg-1DIO)以及陽性藥組(20 mg·kg-1FLU)，灌胃給藥4周，同時(shí)進(jìn)行CUMS操作。正常組和模型組給予等量的羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液，DIO對(duì)照組給予高劑量薯蕷皂苷(80 mg·kg-1DIO)。

2.3 行為學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)開始前小鼠先進(jìn)行48 h糖水適應(yīng)過程，計(jì)算糖水偏好/%=蔗糖用量/(蔗糖用量+普通水用量)×100%。將小鼠置于裝有25 ℃普通水的透明圓柱體內(nèi)(高20 cm、直徑12 cm)6 min，記錄最后4 min小鼠靜止時(shí)間。將小鼠尾巴用膠帶固定，頭部朝下6 min，記錄最后4 min小鼠靜止時(shí)間。將小鼠隨機(jī)置于底部分為5×5方格的黑筆白底敞箱內(nèi)，記錄小鼠5 min的行動(dòng)軌跡，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.4 ELISA檢測(cè)小鼠眼球取血，血液放置30 min后離心(3 500 r·min-1) 10 min后取其上清，-80 ℃儲(chǔ)存，備用。小鼠斷頭取腦置于冰盒上，快速分離出完整的腦組織，并將位于腦組織皮層下方的八字形白色組織即海馬組織分離，海馬組織和剩余腦組織分別儲(chǔ)存在-80 ℃(每組隨機(jī)保留兩顆完整腦組織用于組織病理學(xué)檢測(cè))備用。血清CORT、海馬組織BDNF和5-HT含量經(jīng)ELISA法檢測(cè)。

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)取“2.4”所得血清和剩余腦組織，按照試劑盒說明書檢測(cè)血清MDA、SOD和剩余腦組織CAT含量。

2.6 組織病理學(xué)檢查將完整的腦組織置于10%甲醛溶液中浸泡固定，制成蠟塊并切成5 μm的薄片，按照HE和Nissl方法染色，最后置光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.7 正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12 h，通過鼻錐吸入含1.5%異氟醚和98.5%氧氣的混合氣體(流速1 L·min-1)麻醉。尾靜脈1次性注射14.8～18.5 MBq 18F-fluorodeoxyglucose(18F-FDG)示蹤劑200 μL，室溫45 min后進(jìn)行掃描[12]，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.8 Western blot分析取適量剩余腦組織，按照組織蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白；總蛋白濃度經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定后，PBS溶液拉平濃度，2×loading buffer(100 μL+4 μL β-巰基乙醇)進(jìn)行變性；配制適當(dāng)比例的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳后，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉,室溫2 h，然后放入一抗中孵育,4 ℃過夜；次日，PVDF膜用TTBS洗滌后放入對(duì)應(yīng)的二抗中孵育,室溫2 h，然后按照ECL發(fā)光試劑盒的操作說明，觀察并拍照。圖像分析采用Gel-Pro Analyzer專業(yè)圖像分析軟件。

3 結(jié)果

3.1 薯蕷皂苷對(duì)抑郁小鼠行為的影響如Fig 1A所示，與模型組相比，薯蕷皂苷或氟西汀給藥后明顯提高抑郁小鼠的糖水偏好(P<0.05)，改善抑郁小鼠的快感缺失狀態(tài)，其中80 mg·kg-1薯蕷皂苷效果最為明顯(P<0.01)。如Fig 1B-C所示，與模型組相比，薯蕷皂苷給藥后抑郁小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間分別由(173.2±8.326) s、(162.6±6.575) s降低至(101.9±11.25) s、(97.38±11.13) s，顯著改善抑郁小鼠的絕望行為(P<0.01)。在曠場(chǎng)試驗(yàn)中，薯蕷皂苷給藥后明顯增加抑郁小鼠在中心區(qū)域的活動(dòng)距離(P<0.05)，改善抑郁小鼠的焦慮行為(Fig 1D-E)。

Fig 1 Effects of DIO on behavior of depressed mice

3.2 薯蕷皂苷對(duì)抑郁小鼠海馬組織CORT、BDNF和5-HT含量的影響如Fig 2A所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清CORT含量由(110.9±4.959) μg·L-1增加至(152.2±12.28) μg·L-1，薯蕷皂苷給藥后降至(123.3±5.543) μg·L-1。與對(duì)照組相比，模型組小鼠海馬組織內(nèi)BDNF和5-HT含量分別由(5.777±0.176) ng·鮮重(g)-1、(1.591±0.053) μg·鮮重(g)-1降至(4.963±0.092) ng·鮮重(g)-1、(1.215±0.043) μg·鮮重(g)-1；與模型組相比，薯蕷皂苷給藥后小鼠海馬組織內(nèi)BDNF和5-HT含量分別增加至(5.404±0.184) ng·鮮重(g)-1、(1.429±0.062) μg·鮮重(g)-1(Fig 2B-C)。

Fig 2 DIO improved levels of CORT, BDNF and 5-HT of depressed mice

3.3 薯蕷皂苷對(duì)抑郁小鼠MDA、SOD和CAT水平的影響Fig 3A表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中MDA含量由(4.810±0.519 5) μmol·L-1升高至(17.49±1.569) μmol·L-1；與模型組相比，薯蕷皂苷或氟西汀給藥后明顯降低MDA含量。如Fig 3B-C所示，模型組小鼠血清中SOD和腦組織中CAT的含量相對(duì)于對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，薯蕷皂苷給藥后SOD和CAT的含量分別增加至對(duì)照組水平。

Fig 3 Effects of DIO on levels of MDA, SOD and CAT of depressed mice

3.4 薯蕷皂苷對(duì)抑郁小鼠腦組織病理的影響由HE染色結(jié)果可知，模型組小鼠腦組織海馬CA1區(qū)出現(xiàn)部分脂肪變性，而薯蕷皂苷或氟西汀給藥能改善此癥狀(Fig 4A)。Nissl染色結(jié)果如Fig 4B所示，模型組小鼠大腦皮層(Cortex)神經(jīng)元胞質(zhì)染色淺，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列紊亂、松散；不同劑量薯蕷皂苷或氟西汀給藥后，小鼠大腦皮層神經(jīng)元胞質(zhì)染色變深，海馬CA1神經(jīng)元排列相對(duì)有序。

Fig 4 Effects of DIO on histopathology of brain tissues of depressed mice

3.5 薯蕷皂苷對(duì)抑郁小鼠大腦各區(qū)域18F-FDG的標(biāo)準(zhǔn)攝取值的影響對(duì)小鼠大腦各區(qū)域18F-FDG的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與對(duì)照組相比，抑郁小鼠海馬、杏仁體、紋狀體、下丘腦和中腦區(qū)域SUV值明顯降低(P<0.05)，薯蕷皂苷給藥后這些區(qū)域的SUV值明顯上升(P<0.05) (Fig 5)。

Fig 5 Changes of SUV values (B) in various brain regions of depressed mice

3.6 薯蕷皂苷對(duì)抑郁小鼠UCP2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 6A所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織內(nèi)UCP2蛋白表達(dá)水平降低了6.2倍；薯蕷皂苷給藥后UCP2蛋白表達(dá)水平增加至模型組的3.8倍。Fig 6B結(jié)果顯示，與模型組相比，薯蕷皂苷給藥后Nrf2和SOD2蛋白表達(dá)水平分別增加9.0倍和1.3倍。Fig 6C結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠腦組織內(nèi)GLUT1和G6Pase蛋白表達(dá)水平分別增加1.5倍和2.7倍；薯蕷皂苷給藥后GLUT1和G6Pase蛋白表達(dá)水平分別降低下調(diào)至模型組的0.17倍和0.14倍。

Fig 6 Effects of DIO on UCP2 signaling pathway in brain tissues of depressed mice

4 討論

抑郁癥的患病率和死亡率伴隨著人們的心理壓力和精神壓力的增加而增加。CUMS模型模擬了人們?cè)谌粘Ｉ钏庥龅牟涣辑h(huán)境，具有重復(fù)性、有效性、連續(xù)性等特點(diǎn)[13]。臨床上對(duì)于抑郁癥的治療方法多樣，但藥物治療一直是最主要手段。因此，尋找新的抗抑郁活性先導(dǎo)物是必不可缺的。

薯蕷皂苷通過提高海馬區(qū)5-HT水平，增強(qiáng)血清素能系統(tǒng)產(chǎn)生抗抑郁作用[14]。研究證明百合地黃湯有抗抑郁作用，其有效成分之一就是薯蕷皂苷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷可以顯著改善抑郁小鼠的抑郁樣行為，也能提高抑郁小鼠海馬組織內(nèi)BDNF和5-HT含量，降低血清CORT含量，對(duì)抑郁小鼠大腦的病理狀態(tài)也有改善作用。

細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源是線粒體，而在線粒體內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)的解偶聯(lián)蛋白(UCP)中，UCP2表達(dá)最為廣泛，并在控制細(xì)胞ROS的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)UCP2的缺失可能促進(jìn)ROS的積累，從而誘導(dǎo)氧化損傷[17]。除此之外，UCP2及其控制產(chǎn)生的ROS與下丘腦神經(jīng)元群的活動(dòng)有關(guān)，這些神經(jīng)元群參與能量和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的控制[8]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激和能量代謝在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)著舉足輕重的作用[17-18]。本課題組前期已有研究證明,薯蕷皂苷能通過氧化應(yīng)激和能量代謝過程調(diào)整多種疾病，如心血管疾病、非酒精性脂肪肝、二型糖尿病等。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷明顯降低抑郁小鼠血清中MDA含量，顯著升高抑郁小鼠血清中SOD含量和腦組織中CAT含量。同時(shí)，薯蕷皂苷能改善抑郁小鼠大腦能量代謝，明顯增加抑郁小鼠腦組織UCP2、Nrf2、SOD2和G6Pase蛋白的表達(dá)，降低GLUT1蛋白的表達(dá)。因此，薯蕷皂苷發(fā)揮抗抑郁作用可能與其參與氧化應(yīng)激和能量代謝的過程有關(guān)。

綜上，薯蕷皂苷能改善由CUMS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，發(fā)揮抗抑郁作用，此過程可能是通過UCP2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和能量代謝過程進(jìn)行的。