夏 敏, 涂以思, 熊小偉, 牛艾琳, 尹婷婷, 張雅楠, 黃起壬

(1. 江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；南昌大學(xué) 2.藥學(xué)院藥理教研室、3.第三臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006)

近年來(lái)，在世界大范圍的慢性病的排名中，糖尿病的死亡率已升到第二，患者常由于心血管并發(fā)癥而死亡，給社會(huì)、家庭造成沉重負(fù)擔(dān)[1-2]。糖尿病有1型和2型之分，因?yàn)橐葝uβ細(xì)胞天生胰島素分泌不足引起了1型糖尿病，而2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)以慢性高血糖和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)為基本特點(diǎn)[3]，其發(fā)病率呈年輕化趨勢(shì)[4]，大多數(shù)研究認(rèn)為IR先于T2DM的發(fā)生，因此對(duì)于IR的研究尤為重要。

叉頭框(forkhead box，F(xiàn)ox)超級(jí)家族是繼homeodomain、bHLH和bZIP這3個(gè)家族之后的第四大轉(zhuǎn)錄因子超級(jí)家族，叉頭框o(forkhead box o，F(xiàn)oxo)是Fox超級(jí)家族的成員，其結(jié)構(gòu)特征是存在叉頭域，這在Fox家族的所有成員中都普遍存在[5]。其中，哺乳動(dòng)物中的o家族(叉頭框/盒)由Foxo1(FKHR)、Foxo3(FKHRL1)、Foxo4(AFX)和Foxo6組成。Foxos在多種不同的細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，不僅參與了眾多細(xì)胞的生理過(guò)程，而且與人類(lèi)的多種疾病包括癌癥、糖尿病、不孕癥、神經(jīng)退行性病變和免疫系統(tǒng)功能障礙等有關(guān)[6]。例如：肝臟中，胰島素通過(guò)抑制Foxos使葡萄糖的產(chǎn)生減少，同時(shí)使葡萄糖的利用率增加，而肝臟IR會(huì)激活Foxos，引起高血糖、高甘油三酯血癥，并且，F(xiàn)oxos可以誘導(dǎo)肝組織產(chǎn)生IL-1β等炎性細(xì)胞因子，因此其在促進(jìn)肝臟IR和炎癥中發(fā)揮著重要作用[7]。據(jù)報(bào)道Foxos家族成員通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)下游通路與IR有關(guān)。但目前關(guān)于Foxos與內(nèi)皮細(xì)胞IR的聯(lián)系尚未見(jiàn)報(bào)道，各亞型在HG/HF應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR中的表達(dá)如何以及具體哪一個(gè)亞型發(fā)揮了關(guān)鍵作用也不清楚，因此本文探討Foxos在HG/HF應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR中的表達(dá)改變并研究其具體的作用機(jī)制。

血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、IR和炎癥標(biāo)志物的增加是T2DM發(fā)生和發(fā)展的核心因素[8]，但目前關(guān)于血管內(nèi)皮細(xì)胞IR發(fā)生的分子機(jī)制還不十分明確。因此，闡明其發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)于發(fā)現(xiàn)治療T2DM藥物的作用靶點(diǎn)，改善患者的生活質(zhì)量具有重要意義。慢性炎癥反應(yīng)在IR的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要作用。NF-κB是典型的炎癥信號(hào)通路之一，參與了肥胖，且和糖尿病發(fā)病有關(guān)。其信號(hào)通路的激活不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)下游基因的調(diào)控，而且與炎癥密切相關(guān)，并且可以從多種途徑誘發(fā)IR，在IR的形成中起著重要作用[9]。NF -κBp65或p65(也稱(chēng)為RELA)，是核轉(zhuǎn)錄因子，它可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重高脂飲食誘導(dǎo)的慢性炎癥和巨噬細(xì)胞IR[10]；而抑制RELA核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或抑制RELA核轉(zhuǎn)運(yùn)可增加胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和消耗，從而改善巨噬細(xì)胞IR。那HG/HF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞IR是否可以通過(guò)炎癥這條通路發(fā)揮作用，以及沉默F(xiàn)oxo6基因后是否可以通過(guò)此通路逆轉(zhuǎn)IR？以上就是我們所關(guān)注的問(wèn)題。

1 材料

1.1 細(xì)胞株及血清培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)株購(gòu)自美國(guó)ATCC( Catalog No: CRL1730) ；胎牛血清購(gòu)自天津TBD公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京Solarbio公司。

1.2 抗體和試劑NO檢測(cè)試劑盒(20190722)、人內(nèi)皮素-1(ET-1)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(2H-KMLJh311095)均購(gòu)自南京建成；Foxo6兔多克隆抗體(19122-1-AP)、NF-kBp65兔多克隆抗體(96033)、GAPDH鼠多克隆抗體(Ls203561)均購(gòu)自武漢三鷹；AKT-pS473兔單克隆抗體(#9271S)、AKT兔單克隆抗體(#9272S)均購(gòu)自Abcam；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(#22106-01)購(gòu)自Tolobio；SYBR Green(FP171206)購(gòu)自天根；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普洛麥格，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA試劑盒(2H-KMLJh311776)購(gòu)自武漢博士德；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(2H-KMLJ31201mm)購(gòu)自南京卡米洛；ChIP試劑盒(#25268)購(gòu)自Cell Signaling Technology；引物購(gòu)自南昌臻善生物科技公司，小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)購(gòu)自銳博生物有限公司，過(guò)表達(dá)質(zhì)粒RELA(49607-11)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司。

1.3 主要儀器680型酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國(guó))；SmartSpec Plus核酸蛋白分析儀(BIO-RAD，美國(guó))；PCR儀(BIO-RAD，美國(guó))；熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)；流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER，美國(guó))。

2 方法

2.1Foxos在HG/HF處理的HUVECs中的差異性表達(dá)將HUVECs均勻接種于培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為兩組，即Ctrl組和高糖高脂(High glucose and High fat，HG/HF)組，HG/HF組用22 mmol的葡萄糖和0.25 mmol的棕櫚酸(PA)處理細(xì)胞24 h后，兩組均用胰島素(100 nmol·L-1)處理30 min，去除細(xì)胞上清液，采用Trizol法提取各組細(xì)胞RNA，按照Tolobio試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)Foxo1、Foxo3、Foxo4、Foxo6基因的表達(dá)，PCR擴(kuò)增所用引物由南昌臻善生物科技公司合成，F(xiàn)oxo1上游引物：5′-TTGCTGACTTCTGACTCTCCTC-3′，下游引物：5′-ATGTCCAGCGTGGGTATGG-3′；Foxo3上游引物：5′-GAACTCCCTACGCCAGTCTC-3′，下游引物：5′-GCAGCAAAGGACATCATCG-3′；Foxo4上游引物：5′-GCTCCGACTCTTCTGTTGCT-3′，下游引物：5′-AGGCATTCTGTCTTGGCTTG-3′；Foxo6上游引物：5′-GCGGAAAACTCACACCTACC-3′，下游引物：5′-CGGTTGAAGAGAGGGACTGA-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，其中cDNA為2 μL，上下游引物各0.8 μL，PCR循環(huán)數(shù)為39，95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸32 s。

2.2Foxo6 siRNAs沉默效率的篩選實(shí)驗(yàn)將HUVECs均勻接種于六孔板，隨機(jī)分為5組，即control組、control+NC組、control+Foxo6siRNA1組、control+Foxo6siRNA2組、control+Foxo6siRNA3組，除Ctrl組外，其余組分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC、Foxo6siRNA1、Foxo6siRNA2、Foxo6siRNA3 24 h后，采用Trizol法提取各組細(xì)胞RNA，按照Tolobio試劑盒將各組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。也可以用裂解液裂解各組細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞的Foxo6蛋白表達(dá)，F(xiàn)oxo6的分子量為58，從而篩選出沉默F(xiàn)oxo6最顯著的siRNA。

2.3Foxo6 siRNA逆轉(zhuǎn)IR實(shí)驗(yàn)將HUVECs均勻接種于培養(yǎng)皿，隨機(jī)分為4組，即control組、HG/HF組、HG/HF+NC組、HG/HF+Foxo6siRNA3組，除control組外，其余組分別加HG/HF處理細(xì)胞24 h，然后HG/HF+NC組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照，HG/HF+Foxo6siRNA3組轉(zhuǎn)染siRNA3 24 h，收集細(xì)胞上清液檢測(cè)NO和ET-1，收集細(xì)胞通過(guò)Western blot檢測(cè)AKT-pS473的表達(dá)。

將SD雄性大鼠用10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，沿大鼠的胸部和腹部縱向切開(kāi)，剝離大鼠的主動(dòng)脈，用PBS洗干凈，將其移入培養(yǎng)瓶中，放入孵箱孵育3～5 h，然后加入完全培養(yǎng)基(含10%FBS、肝素鈉和生長(zhǎng)因子ECGS)，待其生長(zhǎng)狀態(tài)良好，傳代置培養(yǎng)皿。將原代培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)隨機(jī)分為4組，即control組、HG/HF組、HG/HF+NC組、HG/HF+Foxo6siRNA3組，收集細(xì)胞上清液檢測(cè)NO、ET-1，收集細(xì)胞通過(guò)Western blot檢測(cè)AKT-pS473的表達(dá)。

2.4 免疫共沉淀法(CoIP)檢測(cè)Foxo6與NF-κBp65相互作用將HUVECs均勻接種于培養(yǎng)皿，按照總蛋白提取方法提取4組處理好的細(xì)胞蛋白，每個(gè)組又分為加入相應(yīng)抗體的IP組、陰性對(duì)照IgG組、未經(jīng)任何處理的input組，除input組外，IP組和IgG組分別加入1 μL NF-κBp65的抗體混懸過(guò)夜；次日IP組和IgG組再分別加入25 μL的瓊脂糖珠使蛋白沉淀，4 ℃混懸儀混勻1～3 h或者過(guò)夜；4 ℃ 2 500 r·min-1離心5 min，留沉淀，加入上樣緩沖液，上樣緩沖液的量根據(jù)加入珠子的量決定，渦旋混勻，煮沸10 min，最后加入適量上樣緩沖液混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆茫ㄟ^(guò)Western blot檢測(cè)Foxo6的蛋白表達(dá)。

2.5 免疫熒光檢測(cè)NF-κBp65亞細(xì)胞定位將細(xì)胞均勻接種于24孔板中，經(jīng)前期處理后，加4%多聚甲醛固定細(xì)胞，隨后加入TritonX-100室溫通透3 min，洗凈后加入5%BSA室溫封閉2 h，然后加入由5%BSA新鮮配制的NF-κBp65的一抗(比例為1:100)4 ℃孵育過(guò)夜，次日加熒光二抗(1:100)室溫孵育2 h，然后DAPI染核，最后熒光顯微鏡下觀察。

2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)NF-κBp65與其靶基因啟動(dòng)子結(jié)合活性

2.6.1細(xì)胞交聯(lián)與樣品制備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求及分組，將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿，加入37%的甲醛溶液固定細(xì)胞，加入10×甘氨酸溶液終止上述固定反應(yīng)，加入含PIC的1X PBS刮下細(xì)胞，收集細(xì)胞離心，去除上清。

2.6.2細(xì)胞核處理和染色質(zhì)剪切 分別將離心完的細(xì)胞用1 mL 1×緩沖液A+DTT+PIC重懸，冰上靜置，3 000 r·min-1，離心5 min沉淀細(xì)胞核。將上清棄去，用緩沖液B+DTT 1 mL重懸細(xì)胞核沉淀，離心去除上清。用緩沖液B+DTT 100 μL繼續(xù)重懸，加微球菌核酸酶，消化DNA為150～900 bp的片段；加0.5 mol·L-1 EDTA使消化停止，離心收集細(xì)胞核沉淀，將其重懸于1×ChIP緩沖液+PIC中，冰上孵育，對(duì)細(xì)胞核樣品進(jìn)行超聲破碎，離心，轉(zhuǎn)移上清，每管取2 μL測(cè)定染色質(zhì)濃度，剩余樣品保存于-80 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6.3染色質(zhì)免疫沉淀 每管加等量的交聯(lián)染色質(zhì)樣品，每個(gè)沉淀反應(yīng)需要用1×ChIP緩沖液補(bǔ)齊到500 μL，并補(bǔ)加適量的200×PIC，將稀釋后的ChIP染色質(zhì)，每個(gè)樣品吸取10 μL作為Input組，保存于-20 ℃；每個(gè)樣品管加3 μL的Foxo6抗體，每個(gè)陰性對(duì)照管加1.5 μL的IgG抗體，每個(gè)陽(yáng)性對(duì)照管加10 μL H3抗體，封嚴(yán)各反應(yīng)管，轉(zhuǎn)子上孵育4 h以上或過(guò)夜。取30 μL ChIP級(jí)蛋白G瓊脂糖微珠加入到每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)中，轉(zhuǎn)子上孵育2 h，沉淀蛋白G瓊脂糖微球，除上清；分別加低鹽漂洗液和高鹽漂洗液洗滌，吸除上清。

2.6.4將染色體從抗體/蛋白G微珠上洗脫并解交聯(lián) 每組對(duì)應(yīng)的Input組分別加入150 μL 1×ChIP洗脫緩沖液，室溫放置；其它每份ChIP免疫沉淀樣品中分別加入150 μL 1×ChIP洗脫緩沖液，進(jìn)行洗脫；沉淀蛋白G瓊脂糖微球，除上清；把每個(gè)樣品管中洗脫下來(lái)的染色質(zhì)上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，并做好標(biāo)記。在所有管中，包括Input組管，都加入6 μL 5 mol·L-1 NaCl和2 μL蛋白酶K，65 ℃孵育2 h。

2.6.5離心柱純化DNA 將750 μL DNA結(jié)合緩沖液加到DNA樣品中混勻，將每組樣品450 μL轉(zhuǎn)移到離心柱中，14 000 r·min-1離心，棄廢液，加漂洗緩沖液，離心，加50 μL DNA洗脫緩沖液，離心。

2.6.6用PCR定量進(jìn)行ChIP富集效率的分析 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)IL-6和TNF-α進(jìn)行定性分析，進(jìn)行ChIP富集效率的PCR定量分析。

2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性構(gòu)建編碼RELA啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用0.5 g空載體或RELA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染control組和HG/HF組的HUVECs細(xì)胞于24孔板，實(shí)驗(yàn)分為4組，即control+NC組、control+RELA組、HG/HF+NC組、HG/HF+RELA組，根據(jù)24孔板的用量，按照說(shuō)明書(shū)操作，根據(jù)公式：螢火蟲(chóng)/海腎熒光素酶進(jìn)行計(jì)算，并以control+NC組的比值為單位1，既可以得到不同處理組的相對(duì)熒光素酶活性。

2.8 ELISA法檢測(cè)NF-κBp65靶基因的表達(dá)按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)IL-6、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算各組的含量。

3 結(jié)果

3.1 IR模型的確立HUVECs IR指標(biāo)常用培養(yǎng)基上清NO、ET-1水平以及Western blot法中AKT-pS473的表達(dá)水平表示，HG/HF組與control組比較，NO水平降低(P<0.05)，而ET-1水平升高(P<0.05)，AKT-pS473的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，表明IR模型的成功建立(Fig 1)。

Fig 1 NO, ET-1 and AKT-pS473 levels of various treatment in cultured HUVECs

3.2Foxos在HG/HF應(yīng)激誘導(dǎo)IR中的表達(dá)變化為了驗(yàn)證Foxos在HG/HF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞IR中是否發(fā)生了變化，采用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)其表達(dá)水平，qRT-PCR的結(jié)果顯示Foxo6在HG/HF組中變化最明顯，并且表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，Western blot的結(jié)果表明Foxo6在HG/HF組中的表達(dá)量也是明顯升高的(P<0.05)(Fig 2)。

3.3 沉默F(xiàn)oxo6 siRNA的篩選3.2中結(jié)果證明Foxo6在HG/HF組中變化最明顯并且表達(dá)量升高，說(shuō)明Foxo6在HG/HF應(yīng)激誘導(dǎo)IR中可能發(fā)揮了重要作用。為了進(jìn)一步闡明Foxo6與IR間究竟是一種伴隨現(xiàn)象還是一種因果關(guān)系，通過(guò)構(gòu)建Foxo6 siRNA，觀察Foxo6水平下調(diào)是否能逆轉(zhuǎn)HG/HF應(yīng)激所誘導(dǎo)的IR效應(yīng)。為此，針對(duì)Foxo6基因設(shè)計(jì)了3個(gè)不同靶位的siRNA序列并構(gòu)建成質(zhì)粒，目的是篩選出沉默效率最高的siRNA，用于后續(xù)的研究。qRT-PCR和Western blot均顯示，F(xiàn)oxo6 siRNA3序列沉默效果最明顯(P<0.05)，因此選取Foxo6 siRNA3序列用來(lái)進(jìn)行后續(xù)研究(Fig 3)。

Fig 3 Foxo6 mRNA and protein expression levels of various treatment in cultured HUVECs n=3)

3.4 沉默F(xiàn)oxo6對(duì)HG/HF應(yīng)激誘導(dǎo)IR的影響實(shí)驗(yàn)分為control、HG/HF、HG/HF+NC、HG/HF+Foxo6siRNA3組。在HUVECs實(shí)驗(yàn)中，與HG/HF組相比，沉默F(xiàn)oxo6后，NO水平明顯升高(P<0.01)，ET-1水平降低(P<0.05)，AKT-pS473的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明沉默F(xiàn)oxo6可明顯逆轉(zhuǎn)HG/HF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞IR(A-C)；在大鼠原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(RAECs)實(shí)驗(yàn)中也得到了類(lèi)似的結(jié)果(D-F)(Fig 4)。

Fig 4 NO, ET-1 and AKT-pS473 levels of various treatment in cultured HUVECs and n=3)

3.5Foxo6沉默對(duì)HG/HF誘導(dǎo)的Foxo6與NF-κBp65相互作用的影響研究表明，IR也是一種慢性炎癥反應(yīng)。NF-κB是炎癥反應(yīng)中最為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。同為核轉(zhuǎn)錄因子的Foxo6是否與NF-κB通路產(chǎn)生相互作用從而調(diào)控HG/HF誘導(dǎo)的IR。為此，探究了Foxo6對(duì)NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路的影響。CoIP結(jié)果顯示，與control組相比，HG/HF組和HG/HF+NC組中Foxo6的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明在HG/HF應(yīng)激下Foxo6與NF-κBp65發(fā)生了相互作用促進(jìn)IR；轉(zhuǎn)染Foxo6 siRNA3之后，F(xiàn)oxo6的表達(dá)水平降低(P<0.05)，表明沉默F(xiàn)oxo6后使其相互作用減弱(Fig 5)。

Fig 5 Interaction between Foxo6 and NF-κBp65 of various treatment in cultured HUVECs n=3)

3.6Foxo6沉默對(duì)HG/HF誘導(dǎo)的NF-κBp65亞細(xì)胞定位的影響免疫熒光結(jié)果顯示，control組NF-κBp65主要位于胞質(zhì)中，而HG/HF組NF-κBp65定位在核內(nèi)，說(shuō)明NF-κBp65在受到HG/HF應(yīng)激后發(fā)生了核轉(zhuǎn)移；沉默F(xiàn)oxo6基因后，NF-κBp65主要定位于核外，揭示沉默F(xiàn)oxo6基因可抑制NF-κBp65的核移位(A)；此外，通過(guò)提取細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)，其結(jié)果與免疫熒光結(jié)果相似(B、C)(Fig 6)。

Fig 6 Expression and location of Foxo6 in nucleus and cytoplasm after Foxo6 was silenced in various treatment in cultured HUVECs n=3)

3.7Foxo6增強(qiáng)NF-κBp65與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性IL-6、TNF-α是NF-κB的下游靶標(biāo)分子，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明HG/HF和HG/HF+NC組中IL-6和TNF-α基因表達(dá)增加(P<0.01，P<0.05)，沉默F(xiàn)oxo6基因后IL-6和TNF-α基因表達(dá)降低(P<0.05)，qRT-PCR結(jié)果表明Foxo6增強(qiáng)NF-κBp65與IL-6和TNF-α的富集效率(Fig 7)。

Fig 7 Silencing Foxo6 inhibited binding activity of NF-κBp65 to its target gene promoter in various treatment in cultured HUVECs n=3)

3.8Foxo6增強(qiáng)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性以及促進(jìn)NF-κBp65靶基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為4組，分別是control+NC組，control+RELA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組，HG/HF+NC組、HG/HF+RELA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，與control+RELA或HG/HF+NC組相比，HG/HF+RELA組中的NF-κBp65的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)，表明Foxo6影響NF-κBp65的轉(zhuǎn)錄活性(A)；IL-6、TNF-α是NF-κB的下游靶標(biāo)分子，炎癥狀態(tài)下IL-6和TNF-α的表達(dá)活性增強(qiáng)。ELISA結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，HG/HF組中IL-6和TNF-α的表達(dá)增加(P<0.01)，表明Foxo6促進(jìn)NF-κBp65下游靶基因的表達(dá)；沉默F(xiàn)oxo6后IL-6和TNF-α的表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，表明Foxo6沉默后可能下調(diào)IL-6和TNF-α的表達(dá)(B、C)(Fig 8)。

Foxos是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族，重要作用包括其可以激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，異常的Foxos功能與神經(jīng)退行性疾病、癌癥和糖尿病[14]等疾病有關(guān)，研究表明Foxos與IR有關(guān)[15]，但其在內(nèi)皮細(xì)胞IR中的作用如何以及具體哪一個(gè)亞型起了關(guān)鍵作用尚不明確，而且Foxos在不同的細(xì)胞和不同的狀態(tài)下發(fā)揮的作用也各不相同。先前的研究認(rèn)為,Foxo6只在大腦中表達(dá)，因此對(duì)Foxo6的研究相對(duì)較少，后來(lái)Foxo6也被證明在多個(gè)組織和器官中表達(dá)，但Foxo6在內(nèi)皮細(xì)胞IR中的表達(dá)和作用以及其具體的作用機(jī)制目前也無(wú)相關(guān)報(bào)道。尤其是近幾年來(lái)，有很多關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞IR的研究，但具體作用機(jī)制還不完全清楚[16]。在實(shí)驗(yàn)中用HG/HF處理HUVECs 24 h成功構(gòu)建IR模型，觀察Foxos在其中的表達(dá)和變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxo6基因變化最顯著，并且在HG/HF組中表達(dá)量升高，因此，選擇Foxo6這一個(gè)變化最明顯的亞型來(lái)進(jìn)行后續(xù)研究。隨后，構(gòu)建了沉默F(xiàn)oxo6的siRNA，并從中篩選出沉默效果最明顯的一條siRNA3鏈進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)NO、ET-1、AKT-pS473等指標(biāo)證明沉默F(xiàn)oxo6可以逆轉(zhuǎn)IR。接下來(lái)進(jìn)一步探討Foxo6促進(jìn)IR的具體作用機(jī)制。造成IR的原因有多種，一是微血管損傷，二是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、三是線(xiàn)粒體功能障礙、四是炎癥，其中炎癥是一個(gè)重要方面，炎癥信號(hào)已經(jīng)成為IR的驅(qū)動(dòng)因素，同時(shí)大量基礎(chǔ)研究表明血管內(nèi)皮的IR在心腦血管疾病的進(jìn)展中起著重要作用，并與炎癥反應(yīng)之間相互影響、相互促進(jìn)[17]。NF-κB作為經(jīng)典的炎癥通路，在調(diào)節(jié)IR中起著重要作用，但NF-κB在內(nèi)皮細(xì)胞IR中起著什么作用，其是否和Foxo6存在相互作用呢？因此，又對(duì)Foxo6是否可以通過(guò)炎癥這條通路促進(jìn)IR進(jìn)行了探索？通過(guò)研究Foxo6是否與NF-κBp65相互作用以及Foxo6是否影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性以及與其下游靶基因的表達(dá)，從而闡明Foxo6促進(jìn)IR的具體作用機(jī)制。

4 討論

IR與T2DM密切相關(guān)，并加速著T2DM的進(jìn)展，同時(shí)血管功能障礙也誘發(fā)了心腦血管疾病[11]。血管IR表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能障礙，其原因主要是由于血管舒張異常所導(dǎo)致[12]，血管內(nèi)皮功能障礙不僅是血管疾病的最初階段，還是代謝性疾病的預(yù)測(cè)因子[13]，此與機(jī)體長(zhǎng)期高水平的血糖濃度和炎癥狀態(tài)密不可分，IR型的糖尿病患者常伴隨高血糖和高血脂，糖和脂又是我們?nèi)粘Ｉ钪兴匦璧臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，攝入過(guò)多對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生極大危害。近幾年來(lái)，有很多關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞IR的研究，但具體的機(jī)制還不完全清楚。對(duì)于前期的研究工作已經(jīng)證明HG/HF可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR，因此，弄清內(nèi)皮細(xì)胞IR的作用機(jī)制對(duì)防治包括糖尿病血管并發(fā)癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有重要意義。

Fig 8 Effects of Foxo6 silencing on NF-κB transcriptional activity (A) and expression of target genes including IL-6 (B) and TNF-ɑ (C)

綜上所述，F(xiàn)oxo6在HG/HF應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞IR中的表達(dá)最顯著，并且表達(dá)量升高，其作用機(jī)制可能是Foxo6與NF-κBp65相互作用從而促進(jìn)IR，F(xiàn)oxo6基因有可能作為T(mén)2DM治療的新靶點(diǎn)，同時(shí)為IR的治療提供一定的理論依據(jù)。但目前只是在細(xì)胞水平證明了Foxo6低表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)IR，其在動(dòng)物水平是否有同樣的結(jié)果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。