王 嬋，許 悅，林紓丞，澹 憶，張樹威，張慧潔，曾曉鋒，李 楨

(昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH),俗稱“冰毒”。因為METH具有高度精神依賴性、神經(jīng)毒性和高復(fù)吸性等特點。目前，在我國METH已經(jīng)超過傳統(tǒng)非法精神活性物質(zhì)，成為最廣泛濫用的一種非法的精神興奮劑。它通過各種因素和各種復(fù)雜途徑作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對其造成不可逆的損害，并引起記憶、認知等功能障礙的并發(fā)癥[1]，上述并發(fā)癥與METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性息息相關(guān)。METH的神經(jīng)毒性機制仍未完全闡明，目前多從ERS、氧化應(yīng)激、細胞凋亡、神經(jīng)炎癥、線粒體應(yīng)激以及細胞自噬等方向進行研究。本文從METH誘導(dǎo)神經(jīng)細胞發(fā)生ERS，以及ERS與神經(jīng)毒性的關(guān)系進行綜述，目的是對ERS和UPR信號通路進行闡述，并對ERS與細胞凋亡、自噬之間的關(guān)系進行總結(jié)，為METH的神經(jīng)毒性機制的研究以及防治提供新的思路。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)憑借自身強大的膜結(jié)構(gòu)以及膜上大量的酶，在調(diào)控各種細胞正常生理功能中起著基礎(chǔ)作用，例如蛋白質(zhì)易位、蛋白質(zhì)折疊、鈣穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)生物合成[2-5]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulumstress，ERS)在外界刺激下，細胞增加了折疊蛋白質(zhì)的需求，使得ER功能發(fā)生紊亂，并導(dǎo)致未折疊或者錯誤折疊的蛋白質(zhì)異常蓄積于ER腔中。這是細胞面對ER穩(wěn)態(tài)被破壞時做出的一系列適應(yīng)性反應(yīng)。這種異常蓄積驅(qū)動了未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)激活，目的是保護細胞免受壓力，減少生物合成負荷，并有助于重建細胞穩(wěn)態(tài)。

UPR涉及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulating protein 78，GRP78/Bip)和3種位于ER膜上跨膜傳感器：肌醇需求因子1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、類蛋白激酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。GRP78/Bip是屬于HSP-70家族，目前GRP78/Bip被視為ERS的標志蛋白之一。正常情況下，GRP78/Bip與IRE1、PERK、ATF6高度結(jié)合，導(dǎo)致3種跨膜傳感器生物活性喪失[3]。當(dāng)發(fā)生ERS時，GRP78/Bip從3個跨膜傳感器分離出來，隨后競爭性結(jié)合這些錯誤折疊蛋白質(zhì)暴露疏水結(jié)構(gòu)域，并使得3種跨膜傳感器接受異常信號，分別激活UPR。

在UPR中，PERK通過二聚化和自身磷酸化翻譯下游因子真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2 alpha，eIF2α)，eIF2α?xí)?dǎo)致ER腔內(nèi)蛋白質(zhì)合成受到抑制。ATF4是一種PERK下游蛋白，其長期表達可誘導(dǎo)CHOP表達增加?；罨腎RE1 可通過參與多種mRNA剪接，降低ER中錯誤折疊的蛋白質(zhì)，其中活化后的IRE1利用自身二聚化和內(nèi)切核糖核酸酶活性的特性，催化XBP1 mRNA的剪接合成為sXBP1[2, 6]。同時，ERS的第三個跨膜傳感器—ATF6易位到高爾基體，其在高爾基體上被位點-1蛋白酶(S1P)和位點-2蛋白酶(S2P)切割，進而產(chǎn)生活性轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子可易位到細胞核并調(diào)節(jié)ERS相關(guān)基因(CHOP、GRP78/Bip和ERAD)成分等基因。上述3條信號通路的激活具有多種效應(yīng)：減少蛋白翻譯、改善ER合成折疊新蛋白質(zhì)的功能和清除錯誤折疊的蛋白[7]。

2 METH與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

Jayanthi等[8]于2004年最先報道METH誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)細胞發(fā)生ERS。隨后，于2009年進一步提出，D1受體的抑制劑SCH23390可以減輕METH誘導(dǎo)小鼠紋狀體神經(jīng)細胞ERS，說明METH可能通過D1受體誘導(dǎo)神經(jīng)細胞發(fā)生ERS。Takeichi等[9]證實低劑量METH能夠誘導(dǎo)小鼠中腦神經(jīng)細胞同樣發(fā)生ERS。Hayashi等[10]報道METH給藥后大鼠VTA區(qū)神經(jīng)細胞發(fā)生ERS。Irie等[11]報道1mM METH處理CA TH.a細胞0～48 h后，GRP78基因轉(zhuǎn)錄增加。Qie等[3]發(fā)現(xiàn)，METH處理BMVEC細胞導(dǎo)致ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK、ATF6以及p-IRE1蛋白呈時間依賴性上調(diào)。METH處理C6細胞可導(dǎo)致ERS相關(guān)蛋白ATF6、p-PERK、p-IRE1出現(xiàn)高表達[6]。Ankit等[2]同樣證實METH可通過ATF6、IRE1以及PERK 3條途徑的激活，進而介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞的Ⅰ型程序性死亡。此外，不僅是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，ERS也可以通過UPR信號通路引起其它系統(tǒng)功能障礙。METH作用于大鼠肺組織后，可激活PERK/eIF2α/ATF4通路造成肺組織的慢性損傷[12]。另外，Wang等[13]也發(fā)現(xiàn)，METH不僅降低了大鼠肺組織中Nrf2及其相關(guān)的抗氧化基因的表達水平，還增加了GRP78的表達以及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP的表達水平，這一結(jié)果可被抗氧化劑TBHQ逆轉(zhuǎn)。這提示METH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可以加重肺組織的ERS，并進一步激活PERK信號通路。

以上研究提示，METH可引起機體發(fā)生持續(xù)的ERS，機體會自動激活I(lǐng)RE1、PERK和ATF6相關(guān)的UPR信號通路，去對抗這種持續(xù)ER功能受損帶來的不良后果。UPR致力于修復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的同時，還通過凋亡、自噬等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對過度損傷的細胞進行清除。但過度的細胞凋亡、自噬又是很多疾病發(fā)生、發(fā)展的根本原因。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在METH誘導(dǎo)細胞凋亡中的作用機制

細胞凋亡(apoptosis)是一種復(fù)雜的生理性細胞死亡機制，是人類和其他生物正常生長發(fā)育所必需的過程。在應(yīng)激條件下，如氧化應(yīng)激和DNA 損傷反應(yīng)，對于具有高增殖率和高表達促凋亡基因的細胞來說，細胞凋亡可以快速發(fā)生。目前，已知細胞凋亡的途徑有：外源性途徑(死亡受體途徑)以及內(nèi)源性途徑(線粒體途徑、ER途徑)。已有較多研究表明在過度ERS反應(yīng)后期可發(fā)生細胞凋亡，ER通過調(diào)節(jié)細胞凋亡加重神經(jīng)細胞損傷，從而加速METH誘發(fā)的精神疾病和神經(jīng)退行性變的病理過程。

ERS途徑參與METH誘導(dǎo)凋亡途徑的機制：

3.1 激活CHOP 途徑CHOP的激活是近些年來的研究ERS途徑介導(dǎo)細胞凋亡的熱點。CHOP由DDIT3基因編碼，是CCAAT/增強結(jié)合蛋白家族(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)成員之一[12]。CHOP具有兩個重要作用。一是作為ERS標志蛋白證明ERS參與損傷過程，二是可作為促凋亡因子。在正常生理狀況下，CHOP蛋白表達量極低；然而，在包括ERS在內(nèi)的多種病理條件下，CHOP的表達急劇上升和細胞凋亡被激活，這個過程可以發(fā)生在各種類型的細胞中[2, 5]。

Qie等[3]利用BMVEC細胞為體外模型的研究對象，發(fā)現(xiàn)METH可通過UPR 3種信號通路激活CHOP蛋白,導(dǎo)致細胞凋亡和BBB內(nèi)皮細胞損傷。Pawaris等[4]發(fā)現(xiàn)METH處理SH-SY5Y細胞可誘導(dǎo)ERS相關(guān)基因(CHOP和剪接的XBP1)呈劑量和時間依賴性增加，進而導(dǎo)致SH-SY5Y細胞發(fā)生凋亡。METH處理星形膠質(zhì)細胞可導(dǎo)致ATF6、PERK以及IRE1通路的激活，這3種機制會啟動相應(yīng)下游信號通路，進一步累積CHOP蛋白從而誘導(dǎo)細胞凋亡[2]。綜上所述，CHOP激活代表了UPR的3個主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的融合。此外，METH可通過CHOP-Trib3途徑參與多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡；敲低CHOP基因后，Xu等[14]觀察到METH誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細胞凋亡水平出現(xiàn)顯著的下降。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)METH處理星型膠質(zhì)細胞后，ERS被激活，METH可通過PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途徑，促進星形膠質(zhì)細胞分泌LCN2(屬于脂質(zhì)運載蛋白家族，與人腦中的細胞死亡有關(guān))。而游離的LCN2與神經(jīng)細胞表面的LCN2R結(jié)合引起神經(jīng)細胞凋亡。Yang等[5]研究表明，METH可使小鼠VTA、NAC腦區(qū)的CHOP、GRP78含量明顯升高，同時，在Trx-1(硫氧還蛋白-1，過表達可阻斷METH誘導(dǎo)的獎賞效應(yīng))高表達轉(zhuǎn)基因小鼠中，CHOP、GRP78含量出現(xiàn)下降。說明ERS是METH損傷小鼠VTA、NAC腦區(qū)的重要機制，并且Trx-1蛋白是ERS的上游負調(diào)控因子。由此可見，通過抵抗CHOP信號通路可抑制ERS對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害從而起到保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。

以上研究表明，CHOP表達的增加是誘導(dǎo)ERS相關(guān)的凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

3.2 激活caspase-12 途徑caspase級聯(lián)反應(yīng)在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于關(guān)鍵地位,是誘導(dǎo)細胞不可逆地走向凋亡的最后環(huán)節(jié)。caspase-12是一種位于ER膜上的具有代表性分子，可通過ERS調(diào)節(jié)細胞凋亡[16]。正常狀態(tài)下，caspase-12位于ER外膜上處于失活狀態(tài)。當(dāng)細胞無法修復(fù)自身的損傷時，pro-caspase-12可被特異性水解酶水解成caspase-12，caspase-12以活性形式進入胞質(zhì)將caspase-9裂解，被裂解的caspase-9具有生物學(xué)活性。激活的caspase-9會驅(qū)動下游的caspase-3激活，最終誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。已有研究表明，METH引起神經(jīng)細胞凋亡與caspase-12有關(guān)。Beauvais等[17]發(fā)現(xiàn)METH可以誘導(dǎo)小鼠紋狀體神經(jīng)細胞發(fā)生ERS以及線粒體功能障礙，同時可使裂解的caspase-12蛋白含量增加。然而這種現(xiàn)象能夠被D1受體抑制劑特異性阻斷。Yang等[5]給予METH后，小鼠腦中ERS標記蛋白GRP78表達水平明顯升高，同時發(fā)現(xiàn)pro-caspase-12的表達顯著降低，caspase-12出現(xiàn)活化。說明METH會使 GRP78激活導(dǎo)致ERS，通過caspase-12途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。CDK5(脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對Tau蛋白具有特異性)蛋白可促進METH上調(diào)SH-SY5Y細胞和SD大鼠海馬區(qū)p-Tau蛋白表達，進而破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑，同時可觀察到p-PERK、caspase-12表達水平升高。敲除CDK5后，上述指標發(fā)生逆轉(zhuǎn)。說明在METH誘導(dǎo)的細胞凋亡、ERS以及Tau蛋白磷酸化3者之間的存在密切聯(lián)系[1]。另外,褪黑素可緩解METH誘導(dǎo)的ERS相關(guān)信號通路的表達，降低caspase-12和caspase-3的表達，減少細胞的凋亡[4]。

由此可見，caspase-12的激活在ERS介導(dǎo)的細胞凋亡的過程中具有關(guān)鍵作用,并且可能成為治療干預(yù)METH導(dǎo)致神經(jīng)毒性的有效手段。

4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在METH誘導(dǎo)細胞自噬中的作用機制

自噬(autophagy)是一個機體自我吞噬分解代謝過程，目的將自噬底物(多余蛋白質(zhì)、特定細胞器、病原體)輸送到溶酶體與其相融合，完成自噬底物的分解，同時進行代謝副產(chǎn)物的回收利用。此過程典型特征是“自噬小體”的形成。從自噬小體的啟動、成熟、直到與溶酶體的融合，是一個復(fù)雜的過程。該過程受30多個自噬相關(guān)基因調(diào)控[18]。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，不管自噬在神經(jīng)系統(tǒng)中“扮演”保護或者損傷的角色，ERS已經(jīng)成為啟動自噬的必要條件之一。Trib3(Tribbles pseudokinase 3)是一種新型ERS標記蛋白，同時也是METH誘導(dǎo)ERS與自噬的連接點。UPR信號通路可激活Trib3蛋白的生物學(xué)活性，并且Trib3能夠靶向作用于Akt-mTOR信號通路，直接參與自噬過程。在高劑量METH誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細胞自噬的實驗中，Xu等[14]發(fā)現(xiàn)METH激活了ERS標志蛋白CHOP和Trib3表達，同時抑制p-Akt、p-mTOR表達；而沉默上游因子Nupr1 (一種ERS誘導(dǎo)劑，在ERS條件下顯著表達)或C/EBPβ(C/EBPs家族成員之一，調(diào)控細胞死亡和存活)發(fā)現(xiàn)，CHOP、Trib3表達水平降低，并且下游的p-Akt、p-mTOR表達升高，從而降低自噬標記蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1表達含量。Tabatabaei等[19]發(fā)現(xiàn)，長期濫用METH死亡者的紋狀體內(nèi)CHOP、Trib3、NUPR1和Beclin-1、LC3 Ⅱ、caspase-3和ATG5的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達增加，同時可導(dǎo)致大量的神經(jīng)元細胞死亡。這表明了NUPR1-CHOP-Trib3通路在METH誘導(dǎo)的自噬中的重要性，并且ERS可能充當(dāng)自噬的上游調(diào)控因子[14, 20]。與此不同，Huang等[21]利用ERS抑制劑預(yù)處理星形膠質(zhì)細胞可顯著抑制METH促使的LC3-Ⅱ和GFAP(一種星形膠質(zhì)細胞活化標志蛋白)表達升高。相反，使用自噬抑制劑進行前干預(yù)，則會促進METH促使的CHOP和GFAR表達升高。由此可見，在METH處理星形膠質(zhì)細胞中ERS與自噬之間存在平行調(diào)控的關(guān)系，并且兩者對神經(jīng)細胞有著不同的激活或者抑制作用。

目前,關(guān)于METH誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬的研究較多,但鮮有ERS在METH誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬中作用的報道。因此，探討兩者之間的分子機制，對進一步闡明METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷作用的新機制具有重要理論及實踐意義。

現(xiàn)對上文提及的ERS在METH誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬所涉及的信號通路進行總結(jié)，如Fig 1所示。

Fig 1 Signaling pathway of ERS in METH induced apoptosis and autophagy

5 藥物在METH誘導(dǎo)細胞ERS中的干預(yù)

5.1 褪黑素褪黑素(melatonin)是由松果體合成和釋放的一種天然的胺類激素。褪黑素除了能調(diào)節(jié)機體的晝夜周期外，還因其強大的抗氧化作用而聞名。研究結(jié)果表明METH通過增加ERS相關(guān)蛋白(p-PERK、p-eIF2α、p-IRE1、ATF6、XBP-1和Bip)的表達，激活下游的CHOP和caspase-12，最終促使膠質(zhì)細胞發(fā)生不可逆的凋亡。而褪黑素逆轉(zhuǎn)METH誘導(dǎo)的這一變化[6]。Pawaris等[4]同樣證明了褪黑激素預(yù)處理可減輕METH誘導(dǎo)的ERS相關(guān)基因的過表達、caspase-12、caspase-3的裂解以及神經(jīng)元凋亡。以上研究結(jié)果提示褪黑激素具有減輕METH誘導(dǎo)細胞發(fā)生ERS的作用。

5.2 PFT-αPifithrin-alpha(PFT-α)是一種p53抑制劑，因其對保護宿主細胞免受放療和化療的毒性，所以常用于腫瘤方面的治療。最近，在腦缺血灌注、帕金森病、阿爾茲海默模型中，已經(jīng)證明PFT-α減輕它們對神經(jīng)元的損害，因此PFT-α具有神經(jīng)保護特性。Chen等[22]發(fā)現(xiàn)，PFT-α可以通過抑制p53易位進入細胞核，降低CHOP表達水平，并利用過表達GLuc-SerCaMP的Sh-sy5y細胞模型證明PFT-α可通過影響ER中鈣離子的穩(wěn)態(tài)，從而誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡。由此可提示PFT-α通過抑制p53核異位和ERS從而拮抗Meth介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元變性。

5.3 分子氫分子氫(molecular hydrogen)是一種具有藥用價值的無毒分子，其除了具有抗氧化作用外，分子氫還可通過減少炎癥和凋亡,從而提供細胞保護。近年來，在中風(fēng)、TBI、PD和AD等病理狀態(tài)下，分子氫已表現(xiàn)出對腦部的顯著保護作用。另外，已有研究表明，分子氫不僅能抑制METH引起的空間學(xué)習(xí)障礙和記憶喪失，還顯著抑制了神經(jīng)細胞中Bax/Bcl-2的比值、caspase-3、GRP78、CHOP、p-NF-κB、p65蛋白的表達水平。除此之外，分子氫還顯著降低了IL-6和TNF-α的含量[23]?？梢姺肿託渫ㄟ^抑制神經(jīng)細胞ERS、氧化應(yīng)激、凋亡以及神經(jīng)炎癥從而減弱METH的神經(jīng)毒性。

5.4 表兒茶素表兒茶素(epicatechin，EC)是一種在綠茶、葡萄籽、杏子和草莓等植物中含量最高的黃烷醇化合物。EC具有廣泛的藥理學(xué)價值，如具有抗癌作用、保護心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的作用以及減少氧化應(yīng)激和炎癥的作用。現(xiàn)已證實，EC可進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進而抑制NADPH氧化酶表達、清除ROS以及促進抗氧化酶生成從而防止因為氧化應(yīng)激，短暫或永久性缺血引起的神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。然而，在Kang等[24]的研究中發(fā)現(xiàn)與此相似的結(jié)論。使用EC提前預(yù)處理HT 22細胞，不僅可以減弱在METH作用下HT 22細胞中ROS生成和MAPK活性、CHOP表達以及D4/5受體表達，同時還能阻止caspase級聯(lián)效應(yīng)，最終抑制細胞凋亡。這證實了EC對METH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和ERS所致神經(jīng)細胞毒性具有保護作用。

5.5 香樹素香樹素(aromadendrin)是從雅潔緬茄木、流蘇樹以及西伯利亞紅松中提取的黃酮類化合物。目前研究證實，香樹素具有清除ROS、抗腫瘤和抗炎等特點。Lee等[25]證實，METH不僅能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞發(fā)生ERS，導(dǎo)致CHOP、C/EBPβ以及ATF6 mRNA表達上調(diào)，還能夠通過PI3K/AKT/mTOP途徑顯著升高自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1，除此之外，METH還可增加caspase-3、caspase-7、Bax(促凋亡蛋白)表達水平以及降低Bcl-2(抗凋亡蛋白)表達水平，而香樹素可以改變METH誘導(dǎo)的這一系列現(xiàn)象。由此可見，香樹素可明顯減弱METH誘導(dǎo)細胞ERS、自噬和凋亡的過程，從而降低METH的神經(jīng)毒性。

褪黑素、PFT-α、分子氫、表兒茶素以及香樹素通過自身的特性抑制不同的ERS信號分子減輕了神經(jīng)細胞的損傷，最終改善了METH的神經(jīng)毒性。因此藥物作用機制以及ERS啟動發(fā)生發(fā)展過程需要進一步探索，這可能為藥物特異性抑制METH神經(jīng)毒性提供新的防治策略。

6 小結(jié)與展望

METH可以導(dǎo)致神經(jīng)細胞中未折疊蛋白蓄積或鈣離子失衡引起ERS，適度的ERS可以緩解ER中的壓力，持續(xù)性的ERS會加重ER的負荷，通過UPR信號通路誘導(dǎo)細胞走向死亡。近些年研究表明，UPR信號分子可以通過激活CHOP、caspase-12兩種途徑介導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。另外，ERS在METH誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬同樣起到重要作用，但目前對ERS調(diào)控自噬的機制報道較少。并且針對METH濫用誘導(dǎo)神經(jīng)細胞發(fā)生ERS的藥物在治療其誘發(fā)的神經(jīng)毒性中具有較良好的醫(yī)學(xué)前景。因此，深入了解ERS的調(diào)控機制，對于METH的神經(jīng)毒性防治具有積極意義。