楊光，姚富，陳永旺，劉玉林

（1.西南醫(yī)科大學，四川瀘州646000；2.四川省骨科醫(yī)院，四川成都610041；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，四川瀘州646000）

Abstarct: Objective To investigate the cerebral protective effect of etomidate in rats with spinal cord injury(SCI), and to analyze the underlying mechanism. Methods Fifty of the 62 SPF male SD rats were used to establish the SCI models, and the successfully-established rat models (n = 48) were randomly divided into model group (n =12),low-dose etomidate group(n=12),medium-dose etomidate group(n=12)and high-dose etomidate group(n=12). The rest 12 rats were set as sham-operation group where only the T9 to T11 vertebral plates were removed without injuring the spinal cord. The low-, medium- and high-dose etomidate groups were injected 0.3 mg/kg, 0.9 mg/kg,and 2.7 mg/kg of etomidate fat emulsion injection,respectively through the tail veins once a day for 4 weeks.The rats in sham-operation group and model group were injected with the same amount of normal saline via tail veins at the same time.The neurobehavioral scores were evaluated after 4 weeks,and the levels of interleukin-1(IL-1β) and IL-18 in the cerebral spinal fluid (CSF) were measured via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe the histopathological changes of the spinal cord in each group. The mRNA levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues of rats were detected by quantitative realtime polymerase chain reaction(qRT-PCR).The protein levels of NLRP3 and Caspase-1 were measured by Western blotting. Results Compared with the sham-operation group,the BBB scores were decreased,the levels of IL-1β and IL-18 in CSF were higher, and the mRNA and protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues were increased in the model group, and low-, medium- and high-dose etomidate groups (P ＜0.05). However, the BBB scores were higher,and the levels of IL-1β and IL-18 in CSF as well as the mRNA and protein levels of NLRP3 and Caspase-1 in spinal cord tissues were lower in the low-, medium- and high-dose etomidate groups than those in the model group(P ＜0.05). Conclusions Etomidate plays a cerebral protective role in SCI,potentially by inhibiting the activation of NLRP3/Caspase-1 pathway and attenuating the inflammatory response.

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是各種原因?qū)е伦倒軆?nèi)神經(jīng)結(jié)構(gòu)及其功能損害而引起的脊髓功能障礙，會導致神經(jīng)系統(tǒng)嚴重并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。隨著我國交通和建筑業(yè)的發(fā)展，SCI 發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其病理生理機制復雜，臨床治療效果非常有限。有研究表明，炎癥反應與SCI 進展關(guān)系密切[2]。依托咪酯是一種短效非巴比妥類靜脈全身麻醉藥物，具有起效快、鎮(zhèn)靜作用完全、對呼吸循環(huán)影響小的特點[3]。周小建等[4]研究顯示，依托咪酯能夠抑制SCI 后炎性介質(zhì)水平，進而抑制脊髓繼發(fā)性損傷。目前依托咪酯對SCI 后腦損傷的保護作用研究少見報道，因此本研究探究依托咪酯對SCI 大鼠的腦保護作用，以期為SCI 后神經(jīng)功能的恢復治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

62只12周齡SPF級SD雄性大鼠，體重180～220 g，平均（200±20）g，購自北京日新科技有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0260。

1.2 主要試劑及儀器

依托咪酯脂肪乳注射液（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20020511），白細胞介素1β（Interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素18（Interleukin-18， IL-18）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒（無錫云萃生物科技有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司），兔抗鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor protein 3， NLRP3）、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）多克隆抗體及山羊抗兔HRP 二抗（艾美捷科技有限公司）。SorvallWX 型超速離心機（北京松信宏澤科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型的復制及分組給藥大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，參考改良Allen's 法復制SCI 模型大鼠[5]。腹腔注射10%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取仰臥位固定于手術(shù)臺上，背部備皮消毒，沿背部中線逐層剝開皮膚去除T9～T11錐板，以質(zhì)量為10 g 的打擊錘，由5.0 cm 高處自由落下錐擊T10脊髓后迅速移開。觀察錐擊瞬間鼠尾出現(xiàn)痙攣性擺動，雙后肢及軀體出現(xiàn)回縮撲動后雙后肢出現(xiàn)癱瘓即為模型復制成功。

共復制SCI 大鼠50 只，死亡2 只，成功48 只，隨機分為模型組及依托咪酯低、中、高劑量組，每組12 只。另取12 只大鼠作為假手術(shù)組，只去除T9～T11錐板，不進行打擊錘錐擊，其余操作同模型組。

依托咪酯低、中、高劑量組大鼠分別尾靜脈注射0.3 mg/kg、0.9 mg/kg、2.7 mg/kg 依托咪酯脂肪乳注射液[6]，1 次/d，連續(xù)4 周；假手術(shù)組和模型組大鼠同時間尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3.2 評估各組大鼠神經(jīng)行為學各組大鼠治療4 周后，觀察大鼠行走，髖、膝、踝關(guān)節(jié)的協(xié)調(diào)情況，觀察時間4 min[7]，采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分觀察大鼠神經(jīng)行為學，分值為0～21 分，0 分表示大鼠神經(jīng)行為功能完全喪失，21 分表示神經(jīng)行為功能完全正常。

1.3.3 樣本采集第4 周神經(jīng)行為學評估結(jié)束后，采集各組大鼠腦脊液[8]。采用10%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定在腦立體定位儀上，剪開頭頸部皮膚找到寰枕。通過PE 連接管將150 μL 微量進樣器與植入式套管連接在一起，套管穿刺枕大池，抽取150 μL 腦脊液用于ELISA 檢測。

將各組大鼠斷頸處死，取損傷區(qū)脊髓組織分成3 部分，其中一部分置于甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（6 μm 厚），用于HE染色；另兩部分保存于液氮中，分別用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blotting 檢測。

1.3.4 ELISA 檢測各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18用人工腦脊液對樣本進行等量稀釋，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，測定各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平[9]。

1.3.5 HE 染色觀察各組大鼠脊髓組織病理學變化取1.3.3 中各組大鼠部分脊髓組織切片，脫蠟水化進行HE 染色，以中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織病理學變化并拍照。

1.3.6 qRT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1 mRNA 的表達提取1.3.3 中各組大鼠部分脊髓組織總RNA 并測濃度，以RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行qRT-PCR 反應[10]?？偡磻w系20 μL：ULtraSYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向游引物各2.0 μL、去離子純化水4.0 μL。反應條件：95℃預變性15 s、60℃變性60 s，共40 個循環(huán)。熔解曲線：60℃至95℃，每15 秒升溫0.3℃。qRT-PCR 引物由上海韻泰信息科技有限公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參， 采用2-ΔΔCt法計算NLRP3、Caspase-1 mRNA 相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 測定各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白的表達從液氮中取出剩余部分脊髓組織，制備組織勻漿，加入裂解液并依據(jù)蛋白提取試劑盒提取組織總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗NLRP3、Caspase-1 及內(nèi)參β-actin，1∶500 稀釋，4℃過夜，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h。顯色、成像，計算蛋白相對表達量[11]。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評分分別為（25.06±3.76）分、（9.87±1.47）分、（13.43±2.05）分、（16.95±2.55）分和（19.87±2.95）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=57.460，P=0.001）。進一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評分降低（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評分高于模型組（P＜0.05），具有劑量依賴性。

2.2 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18水平比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平低于模型組，具有劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18水平比較（n=12，pg/mL，±s）

表2 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18水平比較（n=12，pg/mL，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與依托咪酯低劑量組比較，P ＜0.05；④與依托咪酯中劑量組比較，P ＜0.05。

IL-18 265.78±38.96 965.82±145.87①813.25±121.98①②605.68±90.08①②③423.69±63.56①②③④96.635 0.000組別假手術(shù)組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組F 值P 值IL-1β 172.36±25.83 1 506.25±150.23①1 211.77±181.75①②825.69±123.85①②③512.75±75.89①②③④220.049 0.000

2.3 各組大鼠脊髓組織病理學變化

假手術(shù)組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)完整清晰，細胞形態(tài)正常且分布均勻；模型組大鼠脊髓組織內(nèi)有大量空腔，脊髓結(jié)構(gòu)紊亂且有大量炎癥細胞浸潤，脊髓神經(jīng)細胞出現(xiàn)水腫壞死；與模型組比較，依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)紊亂稍減輕，炎癥細胞浸潤減少，且水腫壞死脊髓神經(jīng)細胞減少，此種變化程度隨濃度增加而更明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠脊髓組織病理學變化 （HE染色×400）

2.4 各組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA相對表達量比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相對表達量升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 mRNA 相對表達量低于模型組（P＜0.05），具有劑量依賴性。見表3。

表3 各組大鼠脊髓組織NLRP3和Caspase-1 mRNA相對表達量比較 （n=12，±s）

表3 各組大鼠脊髓組織NLRP3和Caspase-1 mRNA相對表達量比較 （n=12，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與依托咪酯低劑量組比較，P ＜0.05；④與依托咪酯中劑量組比較，P ＜0.05。

Caspase-1 mRNA 1.01±0.16 2.11±0.32①1.95±0.29①②1.63±0.25①②③1.28±0.18①②③④40.745 0.000組別假手術(shù)組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組F 值P 值NLRP3 mRNA 1.00±0.15 2.35±0.36①2.06±0.31①②1.67±0.26①②③1.33±0.19①②③④50.225 0.000

2.5 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1 通路蛋白相對表達量比較

假手術(shù)組、模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對表達量低于模型組（P＜0.05），具有劑量依賴性。見表4和圖2。

圖2 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白的表達

表4 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白相對表達量比較 （n=12，±s）

表4 各組大鼠脊髓組織NLRP3/Caspase-1通路蛋白相對表達量比較 （n=12，±s）

注：①與假手術(shù)組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與依托咪酯低劑量組比較，P ＜0.05；④與依托咪酯中劑量組比較，P ＜0.05。

Caspase-1蛋白0.31±0.05 1.17±0.17①0.92±0.14①②0.73±0.11①②③0.45±0.07①②③④106.606 0.000組別假手術(shù)組模型組依托咪酯低劑量組依托咪酯中劑量組依托咪酯高劑量組F 值P 值NLRP3蛋白0.25±0.04 1.28±0.18①1.05±0.16①②0.72±0.11①②③0.51±0.08①②③④130.348 0.000

3 討論

SCI 是臨床常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有較高發(fā)生率、致殘率，低病死率及年輕化的特點，目前臨床仍無有效治療手段，患者近期及遠期療效均不理想[12]。有研究表明，SCI 病理生理機制復雜，且SCI 往往導致?lián)p傷節(jié)段以下的神經(jīng)行為功能障礙，嚴重影響患者生活質(zhì)量，給社會及家庭造成沉重負擔[13]。因此探尋有效治療藥物及新型治療靶點對改善患者預后具有較大意義。依托咪酯是一種非巴比妥類催眠性靜脈全身麻醉藥物，是咪唑類衍生物，安全性大，是常用的麻醉誘導藥物之一[14]。有研究結(jié)果顯示，依托咪酯能夠改善頸髓損傷患者脊髓部分功能，提高患者生活質(zhì)量[15]。

BBB 評分主要是針對截癱平面以下的神經(jīng)運動功能進行評價，用于SCI 大鼠后肢運動功能恢復過程評價，反映SCI 病情嚴重程度[16]。本研究復制SCI 大鼠模型后，與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評分降低，但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠BBB 評分高于模型組，具有劑量依賴性，說明依托咪酯可能對SCI 大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，即發(fā)揮腦保護作用，進而有助于脊髓神經(jīng)運動功能的再生及恢復。有研究表明，早期微循環(huán)障礙所致炎癥級聯(lián)反應可能在繼發(fā)性SCI 中發(fā)揮關(guān)鍵作用；IL-1β、IL-18均是具有多種生物學功能的炎癥細胞因子，可促進神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡，進而加重SCI 繼發(fā)性損傷[17]。鎖志剛等[18]研究顯示，IL-18 在SCI 大鼠脊髓組織中高表達，促進SCI 繼發(fā)性損傷。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平升高；但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠腦脊液IL-1β、IL-18 水平低于模型組，具有劑量依賴性，說明依托咪酯可能通過抑制炎癥反應進而發(fā)揮腦保護作用。

NLRP3 是一種多蛋白復合物，NLRP3 炎癥小體受到刺激后可剪切Caspase-1，促使Caspase-1 活化，活化的Caspase-1 進一步活化下游蛋白，進而促使大量炎癥因子如IL-1β、IL-18 等釋放，加重炎癥反應[19]。蔣偉宇等[20]研究顯示，抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，可促進SCI 兔神經(jīng)功能的恢復。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3和Caspase-1 蛋白相對表達量升高；但依托咪酯低、中、高劑量組大鼠脊髓組織NLRP3 和Caspase-1 蛋白相對表達量低于模型組，具有劑量依賴性。說明依托咪酯可能通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，抑制炎癥反應，進而發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，依托咪酯發(fā)揮SCI 腦保護作用可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1 通路活化，抑制炎癥反應實現(xiàn)的。然而本研究并未能明確依托咪酯對NLRP3/Caspase-1 通路的具體調(diào)控作用，后期應進行深入闡述。