高繼英，石代樂，王鵬飛，李永，張玉，喬建新，張秀峰，劉春江，劉熙鵬

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.神經(jīng)外科高壓氧艙室，2.神經(jīng)外科，3.醫(yī)學(xué)影像中心，河北張家口075000）

顱腦損傷是一種常見創(chuàng)傷，其神經(jīng)功能恢復(fù)關(guān)系到患者預(yù)后及生活質(zhì)量[1]。血管新生是顱腦損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的重要部分，早期血管生成能改善局部供應(yīng)血液，為腦組織提供營養(yǎng)物質(zhì)，修復(fù)神經(jīng)功能[2-3]。尼莫地平是一種二氫吡啶鈣通道拮抗劑，能有效透過血腦屏障。有研究顯示，尼莫地平能夠改善患者認(rèn)知功能，推測(cè)其對(duì)腦部神經(jīng)功能恢復(fù)具有一定作用[4-6]。目前，臨床上關(guān)于尼莫地平對(duì)顱腦損傷模型大鼠早期血管生成的研究較少，因此本研究通過復(fù)制顱腦損傷大鼠模型，探究尼莫地平對(duì)顱腦損傷模型大鼠早期血管生成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)、8 周齡、SD 雄性大鼠25 只，體重185～215 g，平均（200±15）g，購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許證號(hào)：SYXK（冀）2019-0040。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑尼莫地平（亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H14022821，規(guī)格：20 mg），戊巴比妥鈉（上海橋星貿(mào)易有限公司，CAS 號(hào)：57-33-0），中性多聚甲醛（常州貝源鑫生物科技有限），大鼠CD34 免疫組織化學(xué)試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司），大鼠低氧誘導(dǎo)因子lα（hypoxia inducible factor-lα， HIF-lα）、促血管生成素2（Angiopoietin-2，Ang-2）酶聯(lián)免疫試劑盒（上海一基實(shí)業(yè)有限公司），兔抗大鼠Akt、PI3K 及ERK1/2 單克隆抗體、山羊抗兔Akt、PI3K 及ERK1/2 二抗（上海酶研生物科技有限公司）。

1.2.2 主要儀器-80℃低溫冷藏箱（南京貝登醫(yī)療股份有限公司，型號(hào)：HD-86L830），離心機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)：M1324R），石蠟切片機(jī)（北京佳源興業(yè)科技有限公司，型號(hào)：HS-3315），電泳儀（上海土森視覺科技有限公司，型號(hào)：164-5056）。

1.3 方法

1.3.1 顱腦損傷模型大鼠的復(fù)制及分組隨機(jī)選取8 只大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠復(fù)制顱腦損傷模型[7]。大鼠稱重后，均腹腔注射2% 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。根據(jù)自由落體打擊損傷法：剔除大鼠頂枕部毛，常規(guī)消毒后沿中線切開頭皮，分離軟組織，將顱骨暴露于視野中，在保證硬腦膜完整的前提下，于人字縫前約2 mm，中線旁約2 mm 處，做一直徑為4 mm 的圓形骨窗，采用小錘（致傷力度為25 g）于25 cm 高度下落，落于右側(cè)硬腦膜，造成顱骨損傷，用骨蠟封閉顱骨損傷區(qū)域，并縫合頭皮，觀察大鼠生命體征、角膜反射、肢回縮、后肢屈曲反射，以翻正反應(yīng)出現(xiàn)、自行爬動(dòng)作為模型復(fù)制成功。

模型復(fù)制過程中1 只大鼠死亡，其余大鼠隨機(jī)分為模型組和尼莫地平組，每組8 只。術(shù)后所有大鼠正常飼養(yǎng)，尼莫地平組給予1 mg/（kg·d）尼莫地平，連續(xù)灌胃7 d；對(duì)照組和觀察組給予等量生理鹽水。

1.3.2 標(biāo)本采集及處理治療結(jié)束后，采集大鼠股動(dòng)脈血5 ml，室溫下放置1 h，2 000 r/min 離心10 min，離心半徑10 cm，提取上清液，置入-80℃冰箱冷凍保存。所有大鼠用10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，迅速斷頭處死，打開顱腔取腦，避免損傷腦組織與硬腦膜，將各組4 只大鼠右側(cè)腦組織置于4%中性多聚甲醛固定，用于CD34 免疫組織化學(xué)和蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色。取出另外4 只大鼠右側(cè)腦組織后，迅速置于液氮中10 min，然后于-80℃冷藏箱中保存，用于檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分根據(jù)Zea-longa 評(píng)分[8]，將大鼠行為分為8 個(gè)等級(jí)，評(píng)分為0～7 分，大鼠無不對(duì)稱活動(dòng)為0 分；提尾后，大鼠右側(cè)前肢不能伸展完全為1 分；提尾后，前側(cè)右肢不能伸展完全同時(shí)活動(dòng)障礙為2 分；大鼠右側(cè)前肢貼胸為3 分；大鼠活動(dòng)時(shí)明顯向右轉(zhuǎn)彎為4 分；向右轉(zhuǎn)彎同時(shí)右側(cè)前爪向后拖地為5 分；原地右轉(zhuǎn)圈為6 分；無法站立，只能右側(cè)躺為7 分。

1.3.4 大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)及微血管密度（microvessel density, MVD）檢測(cè)取固定后的腦組織，脫水后石蠟包埋，將損傷部位及其周圍組織切片（厚4 μm），按照CD34 免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行染色，血管內(nèi)皮細(xì)胞為淺棕或棕黃色的顆粒為CD34 陽性，單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞為1 個(gè)血管單位，隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，觀察并計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和MVD[9]。

1.3.5 大鼠血清HIF-lα、Ang-2 水平檢測(cè)取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清HIF-lα、Ang-2水平，并嚴(yán)格按照HIF-lα、Ang-2 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作[10]。

1.3.6 大鼠腦組織病理檢查取固定后的腦組織，脫水后石蠟包埋，切片約4 μm 厚，HE 染色后置于光鏡下，觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化[11]。

1.3.7 Western blotting 檢測(cè)Akt/ERK 通路蛋白的表達(dá)取液氮保存的腦組織，研磨成勻漿后，加入裂解液，離心后取上清液進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。加入上樣緩沖液后進(jìn)行電泳，分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后采用脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠一抗，4℃孵育過夜，沖洗后，再加入羊抗兔二抗，室溫孵育1h，經(jīng)ECL 顯影得到結(jié)果[12]。目的蛋白與β-actin 蛋白灰度值的比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

對(duì)照組、模型組、尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分分別為（0.00±0.00）分、（4.42±0.61）分和（2.57±0.78）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=120.607，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、尼莫地平組高于對(duì)照組（P＜0.05）；且模型組高于尼莫地平組（P＜0.05）。

2.2 大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和MVD比較

對(duì)照組、模型組、尼莫地平組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和MVD 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、尼莫地平組均多于對(duì)照組（P＜0.05）；且模型組均少于尼莫地平組（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)及MVD比較 （n=8，±s）

表1 3組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)及MVD比較 （n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組模型組尼莫地平組F 值P 值MVD/（條/mm2）6.08±0.95 8.82±0.68①12.11±1.87①②44.998 0.000血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)/（個(gè)/HP）68.19±6.28 113.92±5.58①156.25±6.83①②397.108 0.000

2.3 大鼠血清HIF-lα、Ang-2水平比較

對(duì)照組、模型組、尼莫地平組大鼠HIF-lα、Ang-2水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、尼莫地平組均高于對(duì)照組（P＜0.05）；且模型組均低于尼莫地平組（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血清HIF-lα、Ang-2水平比較（n=8，ng/mL，±s）

表2 3組大鼠血清HIF-lα、Ang-2水平比較（n=8，ng/mL，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組模型組尼莫地平組F 值P 值A(chǔ)ng-2 11.83±6.14 39.82±9.35①79.85±12.26①②101.842 0.000 HIF-lα 14.19±4.28 45.92±5.58①84.86±7.31①②292.246 0.000

2.4 大鼠腦組織的病理檢查結(jié)果

對(duì)照組腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)纖維整齊排列。模型組損傷部位出現(xiàn)細(xì)胞和血管壞死，神經(jīng)元細(xì)胞周圍腫脹，細(xì)胞間隙增大，部分神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，毛細(xì)血管腫脹，管壁結(jié)構(gòu)部分破損。尼莫地平組腦組織部分神經(jīng)細(xì)胞死亡，水腫減輕，神經(jīng)細(xì)胞排列略微紊亂，部分細(xì)胞仍見細(xì)胞質(zhì)凝集，局部可見血管著色密集。見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織病理切片 （HE×400）

2.5 大鼠Akt/ERK通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組、模型組、尼莫地平組大鼠PI3K、pAkt/Akt、（pERK1/2）/（ERK1/2）蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：模型組、尼莫地平組均高于對(duì)照組（P＜0.05）；且模型組均低于尼莫地平組（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 3組大鼠Akt/ERK通路蛋白相對(duì)表達(dá)情況比較（n=8，±s）

表3 3組大鼠Akt/ERK通路蛋白相對(duì)表達(dá)情況比較（n=8，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組模型組尼莫地平組F 值P 值（pERK1/2）/（ERK1/2）0.41±0.02 0.59±0.04①0.81±0.03①②377.655 0.000 PI3K 0.22±0.03 0.55±0.06①0.89±0.04①②441.574 0.000 pAkt/Akt 0.24±0.04 0.48±0.06①0.72±0.06①②157.091 0.000

圖2 大鼠腦組織Akt/ERK通路蛋白的表達(dá)

3 討論

血管新生是顱腦損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的重要機(jī)制，能夠?yàn)槭軗p區(qū)域的組織及細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，改善血液循環(huán)，加速腦組織及神經(jīng)功能的修復(fù)[13-14]。有研究顯示，血管生成與腦部損傷的預(yù)后有關(guān)，因此血管生成成為腦部疾病研究的新熱點(diǎn)[15]。治療性血管生成是指通過藥物促進(jìn)血管生成[16]。尼莫地平一般用于改善急性腦血管病的血液循環(huán)，在早期血管生成方面研究較少，本研究通過復(fù)制顱腦損傷模型大鼠，探究尼莫地平通過Akt/ERK 通路對(duì)早期血管生成的影響，為顱腦損傷后的疾病恢復(fù)提供證據(jù)支持。

本研究對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估，通過神經(jīng)修復(fù)體現(xiàn)血管新生情況，結(jié)果顯示模型組大鼠神經(jīng)功能損傷，而尼莫地平對(duì)神經(jīng)損傷具有一定的修復(fù)作用。內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和MVD 能夠反映血管新生的強(qiáng)度，本研究中，模型組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和MVD 多于對(duì)照組，表明在顱腦損傷后，機(jī)體會(huì)形成部分新生血管，而尼莫地平組內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和MVD 均多于對(duì)照組和模型組，提示在尼莫地平的作用下，血管的新生作用更強(qiáng)。

HIF-lα 為低氧誘導(dǎo)因子，在缺氧條件下能夠調(diào)節(jié)多種基因，具有改善能量代謝、減少腦組織及神經(jīng)細(xì)胞受損的作用，同時(shí)HIF-lα 能促進(jìn)血管生成。有研究證實(shí)，HIF-lα 對(duì)改善腦缺血再灌注的嚴(yán)重程度和預(yù)后有重要意義[17]。Ang 家族因子促進(jìn)血管新生的作用更強(qiáng)，Ang-2 是Ang 家族因子中的一種分泌型因子[18]。相關(guān)研究表明，正常情況下Ang-2 僅表達(dá)于血管重建部位，其在組織損傷修復(fù)過程中具有重要意義，Ang-2 在VEGF 的作用下能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)新生血管的形成[19]。本研究中尼莫地平組Ang-2 明顯高于對(duì)照組和模型組，提示尼莫地平對(duì)顱腦損傷模型大鼠早期血管生成有促進(jìn)作用。

本研究對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行病理檢查，結(jié)果顯示對(duì)照組腦組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)纖維整齊排列；模型組損傷部位出現(xiàn)細(xì)胞和血管壞死，神經(jīng)元細(xì)胞周圍腫脹，細(xì)胞間隙增大，部分神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，毛細(xì)血管腫脹，管壁結(jié)構(gòu)部分破損。經(jīng)尼莫地平給藥后，腦組織部分神經(jīng)細(xì)胞死亡，水腫減輕，神經(jīng)細(xì)胞排列略微紊亂，部分細(xì)胞仍見細(xì)胞質(zhì)凝集，局部可見血管著色密集，表明在尼莫地平的作用下，腦組織神經(jīng)受損情況明顯改善，并有新生血管形成。

Akt/ERK 通路包括PI3K/Akt 信號(hào)通路和ERK1/2信號(hào)通路。PI3K/Akt 通路中，Akt 通常為失活狀態(tài)，磷酸化后活化，形成pAkt，能夠激活PI3K/Akt 通路，其中Akt 參與細(xì)胞增殖、凋亡，而PI3K 是細(xì)胞中重要的信號(hào)蛋白，能夠調(diào)控Akt 的活化[20]。ERK1/2 能夠傳導(dǎo)絲裂酶原信號(hào)，激活后形成pERK1/2，能調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，刺激多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，加速細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，有利于血管的新生[21]。本研究中，模型組pAkt/Akt、PI3K及（pERK1/2）/（ERK1/2）蛋白表達(dá)上調(diào)，表明大鼠顱腦損傷后，部分通路被激活，而尼莫地平組Akt/ERK 相關(guān)蛋白表達(dá)均上調(diào)，提示Akt/ERK 通路在莫地平的作用下被激活。

綜上所述，尼莫地平能夠促進(jìn)顱腦損傷模型大鼠早期血管生成，其作用機(jī)制可能與Akt/ERK 通路有關(guān)。本研究僅表明Akt/ERK 通路可能與顱腦損傷模型大鼠早期血管生成有關(guān)，為進(jìn)一步驗(yàn)證Akt/ERK 通路在顱腦損傷模型大鼠早期血管形成中的作用，后續(xù)可將該通路上下游蛋白敲除，進(jìn)行深入研究，為顱腦損傷的治療提供更充分的證據(jù)支持。