羅芳，高琴，費(fèi)志醫(yī)

（武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院，湖北武漢430081）

宮頸癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第3 位，也是引起女性惡性腫瘤患者死亡的主要原因[1]。p38是促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）的同工酶之一，有研究證實(shí)其過表達(dá)對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有促進(jìn)作用[2]。有研究顯示，免疫抑制在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，腫瘤免疫已成為腫瘤治療的新思路[3]。自然殺傷（natural killer， NK）細(xì)胞可以靶向識別腫瘤細(xì)胞，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞壞死。有研究顯示，低水平的NK 細(xì)胞與宮頸癌患者預(yù)后不良和更差的化療反應(yīng)關(guān)系密切[4-5]。白樺脂醇是一種從樺樹皮中提取的三萜類化合物，具有抗炎、抗菌和抗病毒活性。有研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[6]，對乳腺癌也有抑制作用[7]，但是其在宮頸癌中的作用尚不清楚。本研究主要分析白樺脂醇調(diào)控p38 途徑對宮頸癌小鼠NK 細(xì)胞殺傷力及淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa（美國ATCC 公司）。SPF級BALB/C 雌性裸鼠，4 周齡，體重（12±1）g，購自北京維通利華公司，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2015-0001；實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0010。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基血清和抗體（美國Invitrogen 公司），CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），白樺脂醇（美國Sigma 公司），p38 通路抑制劑SB203580（美國Selleck 公司），抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000 稀釋，#ab6721）（美國Abcam 公司），硝酸纖維素膜（美國EMD Millipore 公司），ECL 顯色試劑盒（美國Thermo Fisher公司），光學(xué)顯微鏡（美國Nikon 公司）。

1.3 實(shí)驗分組

將DMEM 培養(yǎng)基中處于對數(shù)生長期的HeLa 細(xì)胞重新配置密度為1×107個/mL 的溶液。所有小鼠左側(cè)前肢皮下注射0.2 mL 細(xì)胞溶液復(fù)制宮頸癌裸鼠模型，7 d 后觸摸到瘤體生成則提示模型復(fù)制成功。隨機(jī)選擇45 只模型復(fù)制成功的小鼠分為模型組、白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組，每組15 只。另取15 只未做處理的小鼠作為對照組。模型復(fù)制成功后第8 天，白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580組小鼠使用白樺脂醇灌胃，劑量100 mg/kg，1 次/d[8]。白樺脂醇+SB203580 組小鼠通過腹腔注射SB203580來抑制p38 通路，劑量50 ng/kg，2 次/周。

1.4 方法

1.4.1 腫瘤生長情況每天觀察腫瘤生長情況，在第28 天用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤長度和寬度，計算腫瘤體積，體積=[（長度×寬度）/2]3×0.5236。模型復(fù)制成功后第28 天頸脫臼處死小鼠，取出腫瘤組織并稱重。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色將宮頸腫瘤組織固定于10%甲醛，石蠟包埋，切成4 μm 厚的切片。將切片放在涂有0.1%聚L 賴氨酸的載玻片上，二甲苯脫蠟，100%～70%梯度乙醇逐漸水合，磷酸鹽緩沖液洗滌。隨后用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）處理，對組織切片進(jìn)行熱誘導(dǎo)修復(fù)。在室溫下，將玻片用30%過氧化氫溶液處理10 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液沖洗后，在室溫下用5%胎牛血清白蛋白封閉玻片10 min，加入anti-Ki67（1∶100 稀釋）抗體，在4℃條件下孵育過夜。磷酸鹽緩沖液洗滌后，將每張玻片與特定的生物素化二抗在37℃條件下孵育60 min，用3，3′-二胺苯聯(lián)苯胺和蘇木精復(fù)染。顯微鏡下觀察切片，用半定量法分析。染色強(qiáng)度=染色評分（0～3 分）×染色范圍（0～4 分）。

1.4.3 Western blotting 檢測p38 蛋白的表達(dá)宮頸癌組織研磨、裂解后4℃、12 000 r/min 離心5 min，收集總蛋白。通過8% SDS-PAGE 分離每個標(biāo)本中等量蛋白質(zhì)（50 μg），并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，將膜浸入5%脫脂牛奶2 h，封閉非特異性抗原。然后將膜與p38、pp38 一抗在4℃條件下孵育過夜，將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑和Quantum One軟件分析灰度，計算蛋白相對表達(dá)量。

1.4.4 脾臟指數(shù)小鼠處死后立即稱重，分離并取出脾臟，稱重，計算脾臟與體重的比值作為脾臟指數(shù)。

1.4.5 NK細(xì)胞殺傷力在無菌環(huán)境下收集脾臟細(xì)胞懸液，用DMEM 培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個/mL 作為效細(xì)胞。然后將HeLa 細(xì)胞也調(diào)整成相同密度作為靶細(xì)胞。在96 孔板中，按照效/靶比例25∶1 加入脾臟細(xì)胞懸液180 μL 和HeLa 細(xì)胞20 μL 作為實(shí)驗細(xì)胞。37℃、5%CO2環(huán)境下孵育48 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的光密度（optical density， OD）值。分別設(shè)置200 μL 效細(xì)胞孔及200 μL 靶細(xì)胞孔，進(jìn)行上述處理后測定OD 值。NK 細(xì)胞殺傷力={1-[（OD實(shí)驗-OD效）/OD靶]}×100%。

1.4.6 淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗按照1.4.5 中方法收集脾細(xì)胞，經(jīng)過密度梯度離心后抽吸淋巴細(xì)胞層，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。將100 μL 細(xì)胞懸浮液添加到96 孔板中，孵育48 h 后每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的OD值表示淋巴細(xì)胞增殖活力。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白樺脂醇對宮頸癌的抑制作用

模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組小鼠腫瘤體積比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組腫瘤體積小于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組小于白樺脂醇組（P＜0.05）。見表1。

模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組小鼠腫瘤質(zhì)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組腫瘤質(zhì)量小于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組小于白樺脂醇組（P＜0.05）。見表1。

表1 3組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較 （n=15，±s）

表1 3組小鼠腫瘤體積和質(zhì)量比較 （n=15，±s）

注：①與模型組比較，P ＜0.05；②與白樺脂醇組比較，P ＜0.05。

組別模型組白樺脂醇組白樺脂醇+SB203580組F 值P 值體積/mm3 315.24±24.38 232.56±19.57①168.02±14.91①②37.028 0.000質(zhì)量/g 0.35±0.05 0.27±0.04①0.20±0.03①②32.458 0.000

2.2 白樺脂醇對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

對照組、模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組免疫組織化學(xué)染色評分分別為（1.04±0.08）分、（9.23±0.86）分、（5.49±0.57）分和（3.15±0.24）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=49.742，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組免疫組織化學(xué)染色評分低于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組低于白樺脂醇組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 白樺脂醇對宮頸癌組織中Ki67蛋白的影響（免疫組織化學(xué)染色）

2.3 白樺脂醇對宮頸癌組織中p38 蛋白磷酸化的影響

對照組、模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組p38 蛋白相對表達(dá)量分別為（0.24±0.02）、（2.28±0.19）、（1.27±0.10）和（0.42±0.04），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=76.214，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組p38 蛋白相對表達(dá)量低于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組低于白樺脂醇組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 白樺脂醇對宮頸癌組織中p38蛋白磷酸化的影響

2.4 白樺脂醇對宮頸癌小鼠脾臟指數(shù)的影響

對照組、模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組小鼠脾臟指數(shù)分別為（9.02±1.15）mg/g、（4.76±0.58）mg/g、（6.61±0.77）mg/g 和（8.25±0.92）mg/g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.527，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組脾臟指數(shù)高于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組高于白樺脂醇組（P＜0.05）。

2.5 白樺脂醇對宮頸癌小鼠NK 細(xì)胞殺傷力和淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

對照組、模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組小鼠NK 細(xì)胞殺傷力比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組NK 細(xì)胞殺傷力高于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組高于白樺脂醇組（P＜0.05）。見表2。

表2 4組小鼠NK細(xì)胞殺傷力和淋巴細(xì)胞增殖活性比較（n=15，±s）

表2 4組小鼠NK細(xì)胞殺傷力和淋巴細(xì)胞增殖活性比較（n=15，±s）

注：①對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與白樺脂醇組比較，P ＜0.05。

淋巴細(xì)胞增殖活性0.89±0.95 0.47±0.56①0.65±0.73①②0.82±0.91①②③39.762 0.000組別對照組模型組白樺脂醇組白樺脂醇+SB203580組F 值P 值NK細(xì)胞殺傷力/%72.58±8.15 44.31±5.34①58.64±6.59①②68.47±7.32①②③36.911 0.000

對照組、模型組、白樺脂醇組、白樺脂醇+SB203580 組小鼠淋巴細(xì)胞增殖活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：白樺脂醇組和白樺脂醇+SB203580 組淋巴細(xì)胞增殖活性高于模型組（P＜0.05），并且白樺脂醇+SB203580 組高于白樺脂醇組（P＜0.05）。見表2。

3 討論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，治療方法包括根治性子宮切除術(shù)、化療、放療和同步放化療。然而宮頸癌復(fù)發(fā)率為10%～50%，5年生存率約為65%[9]。近年來，中藥治療腫瘤取得了重大進(jìn)展，尋找新的抑制宮頸癌的藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

白樺脂醇是一種五環(huán)羽扇豆型三萜類的天然活性化合物，存在于樺樹的外皮中，具有抗菌、抗寄生蟲、抗病毒、抗炎、抗蛇毒血清、內(nèi)臟保護(hù)、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化等作用[10-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，白樺脂醇具有廣泛的抗腫瘤活性，如通過抑制NFκB/c-Myc 通路，抑制乳腺癌細(xì)胞有氧糖酵解[12]。也有研究顯示，白樺脂醇可通過調(diào)控Parkin 依賴性線粒體自噬，提高多藥耐藥腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性[13]。

為進(jìn)一步分析白樺脂醇抑制宮頸癌的機(jī)制，本研究從p38 通路和免疫抑制方面分析了作用機(jī)制。p38 通路是與宮頸癌關(guān)系密切的通路，p38 蛋白磷酸化后，會調(diào)控一系列基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗凋亡等[14]。本研究結(jié)果顯示，白樺脂醇能夠顯著抑制宮頸癌組織中p38 蛋白磷酸化水平。此外，采用SB203580 抑制p38 通路后，會進(jìn)一步提高白樺脂醇對宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用。董蕊等[14]的研究表明，白樺脂醇可抑制p38 通路的激活，抑制黑色素瘤細(xì)胞合成黑色素。也有研究顯示，白樺脂醇可通過調(diào)節(jié)p38 MAPK 通路，減弱T2 毒素引起的胸腺氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。結(jié)合既往研究和本研究結(jié)果，提示白樺脂醇抑制宮頸癌的作用機(jī)制與p38 通路密不可分，白樺脂醇可通過抑制p38 通路中p38 蛋白磷酸化來抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

白樺脂醇也具有關(guān)鍵的免疫調(diào)控作用，免疫抑制也是影響腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要因素。NK 細(xì)胞是在骨髓或者脾臟中成熟的一種免疫細(xì)胞，可識別腫瘤細(xì)胞并分泌穿孔素等引起腫瘤細(xì)胞溶解[16]。宮頸癌患者體內(nèi)NK 細(xì)胞殺傷力降低，并且宮頸癌組織微環(huán)境中浸潤的NK 細(xì)胞水平和活性也降低[17]。有研究顯示，活化的NK 細(xì)胞通過p38 信號殺死肝星狀細(xì)胞[18]。脾臟是T 淋巴細(xì)胞成熟和分化的重要場所，有研究顯示宮頸癌小鼠模型出現(xiàn)脾臟萎縮和免疫抑制[19]。宮頸癌患者體內(nèi)CD3+和CD4+細(xì)胞比例均顯著降低，功能也受到抑制，并使細(xì)胞逃離T 細(xì)胞的識別[20]。p38 可通過調(diào)控體內(nèi)免疫抑制來抑制免疫炎癥反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果表明，宮頸癌小鼠模型NK 細(xì)胞殺傷力降低，脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖活性也受到抑制。而白樺脂醇可顯著提高脾臟指數(shù)和淋巴細(xì)胞增殖活性，并提高NK 細(xì)胞殺傷力，抑制p38 通路會進(jìn)一步提高白樺脂醇對細(xì)胞免疫的促進(jìn)作用。有研究顯示，白樺脂醇提高成熟CD4+和CD8+細(xì)胞的百分比和絕對計數(shù)，增加其在脾臟中的細(xì)胞數(shù)，從而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞亞群[8]。本研究結(jié)果提示，白樺脂醇可通過抑制p38 通路，提高NK 細(xì)胞殺傷力和淋巴細(xì)胞增殖活性。

綜上所述，在宮頸癌小鼠模型中，白樺脂醇通過抑制p38 通路，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖；并且提高NK 細(xì)胞殺傷力和淋巴細(xì)胞增殖活性，提高機(jī)體免疫水平。但是白樺脂醇在宮頸癌中調(diào)控免疫作用的分子機(jī)制仍需要臨床研究證實(shí)。