關冀弛 劉丹 陳艷閣 樊雪 汪海峰

(1 沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧 沈陽 110142； 2 遼寧成大生物股份有限公司)

神經(jīng)細胞二維(2D)貼壁培養(yǎng)是傳統(tǒng)的神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)方法，常應用于神經(jīng)細胞Neuro-2A[1]、SH-SY5Y[2]和PC12[3]等的培養(yǎng)。這種2D培養(yǎng)方法成本低、操作簡便，且細胞生長快，易于大規(guī)模培養(yǎng)。然而，正常的神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞在三維(3D)空間形成的，2D細胞培養(yǎng)不具備體內(nèi)神經(jīng)細胞生長的環(huán)境，難以模擬細胞-細胞和細胞-細胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用[4-5]，因此可能會對神經(jīng)細胞的部分基因、蛋白表達產(chǎn)生影響。而通過選取利于神經(jīng)細胞生長的培養(yǎng)材料和方法，可以更加深入地揭示神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制，同時有助于特異性藥物研發(fā)。

3D細胞培養(yǎng)技術(shù)能使細胞在3D空間中生長并發(fā)生相互作用，使細胞群形成一個3D立體結(jié)構(gòu)。其優(yōu)勢是在空間方面克服了2D培養(yǎng)方式的弊端，能最大程度地模擬神經(jīng)細胞的立體結(jié)構(gòu)，充分發(fā)揮細胞的功能，同時還可支撐神經(jīng)細胞的黏附和伸展分化。3D細胞培養(yǎng)技術(shù)不僅能模擬腦部高度復雜化的3D神經(jīng)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，還能進一步分析腦內(nèi)炎癥情況[6]。目前，神經(jīng)細胞的3D培養(yǎng)技術(shù)可分為兩大類：無支架培養(yǎng)法和支架培養(yǎng)法。

1 無支架培養(yǎng)法

無支架培養(yǎng)法是以細胞本身的附著力為基礎，使細胞聚集成3D結(jié)構(gòu)。主要包括以下幾種方法：神經(jīng)球法、懸滴培養(yǎng)法、微重力旋轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)法(RCCS)及磁性納米粒子培養(yǎng)法等。

1.1 神經(jīng)球法

將神經(jīng)細胞聚集成團狀物細胞集合體，在3D環(huán)境下形成細胞球[7]。這種培養(yǎng)方式操作便捷、易于大規(guī)模培養(yǎng)。然而這種培養(yǎng)方式存在一定的不足：大量神經(jīng)細胞集中于“神經(jīng)球”的內(nèi)部，缺乏運輸養(yǎng)分和代謝產(chǎn)物的通道。隨著“神經(jīng)球”的不斷增大，“神經(jīng)球”內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的交換會出現(xiàn)困難，影響內(nèi)部細胞進一步增長，甚至使內(nèi)部細胞發(fā)生凋亡及壞死，出現(xiàn)中空的現(xiàn)象。因此這種方法培養(yǎng)的神經(jīng)細胞體積會受到限制，神經(jīng)球的培養(yǎng)周期和藥物處置時間亦不能太久。

1.2 懸滴培養(yǎng)法

利用表面張力將細胞懸液滴置于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板底部，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使液滴內(nèi)部的細胞在重力及細胞間附著力的作用下聚集成3D結(jié)構(gòu)[8]。此方法操作比較簡便，不需要特別的儀器設備。其缺點是液體的表面張力無法支撐質(zhì)量和體積較大的細胞懸液，因此細胞懸滴液體的體積一般局限在50 μL以內(nèi)，從而細胞數(shù)量受限。同時這種培養(yǎng)方法在后續(xù)的藥物處理及形態(tài)觀察上操作繁瑣，容易失誤，難以用于大規(guī)模培養(yǎng)。

1.3 RCCS

RCCS主要由同軸旋轉(zhuǎn)的氧化器和細胞培養(yǎng)容器組成[9]。系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)時，細胞培養(yǎng)容器內(nèi)部充滿培養(yǎng)基，且這些培養(yǎng)基可以緊緊圍著水平軸進行轉(zhuǎn)動。在旋轉(zhuǎn)過程中，培養(yǎng)基均以相同的角速度轉(zhuǎn)動，培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細胞在重力、離心力及科氏力的共同作用下呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，進而聚集形成了類組織3D聚合物。在RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的細胞不僅受到的機械外力較小，還能夠得到充足的營養(yǎng)以及氧氣等必備物質(zhì)，可有效促進各種細胞的增殖和誘導分化[10]，利于細胞信號的傳導[11]。同時RCCS無須推進器和攪拌器輔助，剪切力極低，對細胞傷害小，特別適合神經(jīng)細胞的生長。旋轉(zhuǎn)式發(fā)酵罐容積可以做的較大，適合于大規(guī)模的細胞培養(yǎng)[12]。CUI等[13]利用膠原海綿材料建立微重力環(huán)境的RCCS培養(yǎng)神經(jīng)干細胞(NSCs)，通過免疫熒光染色檢測神經(jīng)分化標記物，發(fā)現(xiàn)RCCS系統(tǒng)中膠原海綿培養(yǎng)的NSCs具有良好的神經(jīng)元分化和遷移能力，有助于NSCs的培養(yǎng)和分化。

1.4 磁性納米粒子培養(yǎng)法

該方法主要采用噬菌體、氧化鐵磁性粒子及金納米復合顆粒。噬菌體感染細胞后，磁性納米顆粒轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，在外部磁場的作用下，包含磁性粒子的細胞產(chǎn)生磁性，同時通過對磁場的空間控制，調(diào)控細胞群的幾何形狀[14]。沈亦雯等[15]通過快速聚集無血清懸浮培養(yǎng)法誘導胚胎干細胞轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)前體細胞和皮質(zhì)椎體神經(jīng)元細胞，發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞無須外部誘因即可自主轉(zhuǎn)化為狀態(tài)良好的神經(jīng)細胞，且誘導率極高，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及神經(jīng)組織修復帶來希望。

2 支架培養(yǎng)法

支架系統(tǒng)主要是將細胞接種或分散于疏松多孔的細胞支撐結(jié)構(gòu)支架中，而形成3D形態(tài)的細胞結(jié)構(gòu)。理想支架材料應具備以下特點：無毒且具有良好的生物組織相容性；具有一定孔隙率和良好的表面活性；具有生物可降解性、可塑性和適當?shù)臋C械強度；能促進細胞間黏附和增殖。根據(jù)支架材料及制備方式的不同，分為水凝膠支架、脫細胞支架、靜電紡絲支架，除此之外可制備結(jié)構(gòu)支架的微流控芯片技術(shù)、3D生物打印技術(shù)等也廣泛應用于神經(jīng)細胞的3D培養(yǎng)。

2.1 水凝膠支架

水凝膠由親水聚合物鏈在富水環(huán)境中形成，因其具有良好的生物相容性和3D網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，近年來越來越多地應用于3D細胞的培養(yǎng)[16-17]。

水凝膠的應用較早，分類方法較多，根據(jù)材料種類或來源不同可分為天然水凝膠和合成水凝膠。用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)的天然水凝膠材料通常由海藻酸鈉、膠原、氨基酸和多肽類凝膠因子在體外凝集而成。這類支架材料含水量較高、孔隙較大[18]，為細胞的支撐和細胞間的物質(zhì)交換提供了良好的環(huán)境。CHEN等[19]建立了3D多孔膠原支架用于神經(jīng)元腫瘤干細胞(NCSCs)的培養(yǎng)，神經(jīng)元核免疫染色檢測顯示，80 μm多孔膠原支架可以增強NCSCs的附著、分化能力和細胞活力，為神經(jīng)組織工程和神經(jīng)再生提供了新的研究手段。

合成水凝膠是利用化學材料人工合成3D結(jié)構(gòu)的高分子，常用材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇等。目前，人工合成的水凝膠已經(jīng)商品化，使用較廣泛的是商品名為Matrigel的凝膠，其可通過改變合成材料的分子量大小和交聯(lián)密度來調(diào)節(jié)孔徑大小及生物降解率等，適合用于多種神經(jīng)細胞的3D培養(yǎng)[20-21]。LI等[22]制作了D-甘露醇晶體與甲基丙烯酰胺殼聚糖(MAC)混合凝膠支架，研究神經(jīng)干/祖細胞(NSPCs)于不同孔隙率下的分化機制。結(jié)果表明隨著孔隙率的增大和培養(yǎng)時間的延長，NSPCs分化速率明顯增高，分化產(chǎn)生的顆粒細胞和球周細胞數(shù)量增加，且較大孔徑的MAC水凝膠可有效地促進NSPCs的3D分化。

2.2 脫細胞支架

脫細胞支架是采用化學和物理方法去除組織中的細胞，形成無免疫原性或低免疫原性的材料，用于構(gòu)建神經(jīng)細胞培養(yǎng)的支架[23-24]。按照制備方式不同分為物理法和化學法。常用的物理方法包括高滲鹽法、低滲聯(lián)合凍干法以及反復凍融法，化學法主要采用Triton X-100、Sulfobetaine-10(SB-10)、Sulfobetaine-16(SB-16)等針對神經(jīng)進行脫細胞處理。侯博等[25]通過處理大鼠坐骨神經(jīng)制作成脫細胞支架，采用Triton X-200、SB-10、SB-16聯(lián)合脫氧膽酸鈉及過氧乙酸處理神經(jīng)組織，去除細胞核及可導致免疫原性的神經(jīng)纖維髓鞘成分。結(jié)果顯示支架呈現(xiàn)不規(guī)則多孔狀結(jié)構(gòu)，同時基底膜管壁結(jié)構(gòu)清晰且保留完整，該方法制備出的支架可最大限度保護ECM，具有低免疫原性，可有效促進神經(jīng)細胞再生。

2.3 靜電紡絲支架

靜電紡絲是高分子流體靜電霧化的一種形式，在靜電的作用下霧化分裂出的物質(zhì)不是液滴而是微小射流，然后固化成纖維。通過特定方法可以得到3D結(jié)構(gòu)的納米纖維支架，通過相關參數(shù)可調(diào)控支架的孔隙度、纖維尺寸和形態(tài)等。靜電紡絲支架模仿了ECM結(jié)構(gòu)，可為神經(jīng)細胞的生長提供適宜生長環(huán)境，在對支架表面修飾后，可通過控制生物化學信號來調(diào)控細胞黏附、遷移以及增殖等一系列生物學行為[26-27]。MUTHUSAMY等[28]通過靜電紡絲制作生物合成材料作為細胞支架，進行小腦顆粒細胞的培養(yǎng)，結(jié)果顯示，與對照組比較，此種支架培養(yǎng)方法明顯促進了神經(jīng)軸突的生長。

2.4 微流控芯片技術(shù)

微流控芯片技術(shù)是一種將細胞、組織、化學試劑等樣品從制備、反應到分離檢測等多種操作方式高度集中在芯片上的技術(shù)，通過設計網(wǎng)格狀微通道，以流體控制整個系統(tǒng)。該技術(shù)能將實驗微縮到一個幾平方厘米的芯片上進行，因其具有精準性、便捷性優(yōu)勢，目前廣泛應用于細胞培養(yǎng)、疾病診斷、病例研究及藥物篩選等[29]。目前用于細胞培養(yǎng)的微流控芯片主要以聚二甲基硅氧烷為原料，在其表面雕刻出培養(yǎng)細胞的微通道，再用膠原溶液或者多聚賴氨酸溶液親水處理后接種細胞[30-31]。微流控芯片技術(shù)允許在微米、納米級的通道中對流體進行空間控制，以空間可控的方式共培養(yǎng)多種細胞，可動態(tài)梯度灌注培養(yǎng)，并能實現(xiàn)單個細胞的精確操作。微流控芯片可實現(xiàn)NSCs的定向分化，如KIM等[32]研究該技術(shù)對NSCs的定向分化能力，結(jié)果表明該方法可促進NSCs朝著星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞方向分化，抑制向神經(jīng)元方向分化，為神經(jīng)遞質(zhì)代謝、突觸信號傳遞等過程的研究提供了可能。

2.5 3D生物打印技術(shù)

3D生物打印技術(shù)可以直接將細胞、蛋白及其他具有生物活性的材料(例如蛋白質(zhì)、DNA、生長因子等)作為3D打印的基本單元，以3D打印的方式，直接構(gòu)建體外生物結(jié)構(gòu)體、組織或器官模型。

現(xiàn)階段，3D生物打印技術(shù)的仿生對象通常為ECM[33-34]。ECM中富含膠原蛋白、蛋白多糖和糖蛋白，這些蛋白在提供支撐作用的同時，還可結(jié)合生長因子，參與細胞信號傳導等過程。3D生物打印技術(shù)可制備完整的ECM支架，用于ECM組成、空間分布和生物學功能的分析[35]。利用3D生物打印技術(shù)精準調(diào)控功能性材料的呈現(xiàn)，可實現(xiàn)特異性ECM的體外復制。生物打印仿生還可通過打印細胞或細胞聚集體，產(chǎn)生并沉積ECM，自發(fā)地構(gòu)建出適合細胞自身生長的微環(huán)境，進而促進自身功能的發(fā)揮。SHABANI等[36]研究ECM成分的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)不同ECM混合材料對于NSCs神經(jīng)再生、存活、遷移以及分化等多種生物學功能均具有調(diào)控作用。LEE等[37]以膠原前體為細胞支架，通過3D生物打印技術(shù)將大鼠胚胎神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞打印在支架表面，以碳酸氫鈉溶液為霧化氣溶膠使膠原蛋白凝膠化，構(gòu)建單層或多層3D細胞-水凝膠復合材料，結(jié)果表明，大鼠胚胎神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞生長能力增強，且數(shù)量成比例增加。

3 神經(jīng)細胞3D模型應用

神經(jīng)細胞3D模型可用于神經(jīng)細胞培養(yǎng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制以及治療方案的研究和藥物研發(fā)、篩選等多個方面。

3.1 神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究

常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有帕金森綜合征、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥等，這些疾病給患者及家屬帶來巨大痛苦和經(jīng)濟負擔，故而近年來關于其發(fā)病機制、治療方案以及藥物開發(fā)等的研究發(fā)展迅速[38-40]。通過體外3D培養(yǎng)技術(shù)可對神經(jīng)細胞的發(fā)育狀態(tài)、形態(tài)及其與周圍環(huán)境的關系等方面進行詳細觀察。

CHEN等[41]采用熔融靜電紡絲法制備了高度有序的3D支架并對支架表面進行修飾，研究不同表面修飾等離子體處理后的雙聚D-賴氨酸涂層和粘連蛋白涂層對PC12細胞(成年大白鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤的細胞系)生長的影響。結(jié)果表明經(jīng)等離子體處理后的雙聚D-賴氨酸涂層和粘連蛋白涂層修飾的支架最有效，可顯著促進PC12細胞生長，為神經(jīng)損傷修復提供了一個多功能培養(yǎng)平臺。

WANG等[42]利用脫ECM水凝膠和甲基丙烯酸明膠組成的混合水凝膠體系進行3D神經(jīng)細胞培養(yǎng)和細胞負載生物打印，這種水凝膠技術(shù)可重現(xiàn)組織的功能性，避免了生物打印中擠壓方式對組織的破壞，在再生醫(yī)學領域具有巨大的應用潛力。MA等[43]制備了聚乙烯醇和海藻酸鈉復合水凝膠，在復合水凝膠中隨著聚乙烯醇比例的增高，水凝膠的孔徑和溶脹率增大，彈性模量減小。此外，與海藻酸鈉水凝膠相比，復合水凝膠與小鼠神經(jīng)祖細胞(NPCs)還有良好生物相容性，提高了NPCs增殖能力，為構(gòu)建神經(jīng)組織工程和神經(jīng)疾病模型提供了合適支架。

3.2 藥物篩選

一般利用體外實驗進行候選藥物的安全性研究，體外實驗可以檢測給藥后靶細胞的受損程度、毒副作用、安全性等。藥物的作用價值直接在靶細胞的損傷程度上體現(xiàn)出來，在檢測過程中，安全性實驗可以體現(xiàn)候選藥物的毒副作用和其他不良反應。在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)神經(jīng)細胞，可觀察細胞形態(tài)、發(fā)育潛力及其與毗鄰組織的功能整合性，故而3D細胞培養(yǎng)技術(shù)可應用于藥物的篩選，且效率和安全性更高，結(jié)果更準確[44-45]。

CHANG等[46]以3D類器官技術(shù)誘導人類多能干細胞(IPSCs)向神經(jīng)元細胞分化，用于大規(guī)模神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物篩選和檢測。對阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓小腦萎縮等藥物的研發(fā)提供依據(jù)。GARCIA-LEON等[44]應用人IPSCs產(chǎn)生神經(jīng)細胞為阿爾茨海默病藥物篩選提供相關平臺。

4 展望

神經(jīng)細胞的3D培養(yǎng)技術(shù)正處于快速發(fā)展的階段。神經(jīng)細胞3D培養(yǎng)技術(shù)為闡明神經(jīng)疾病的發(fā)病過程、機制以及特異性藥物的研發(fā)提供了基礎。但其仍存在一些缺陷：由于3D培養(yǎng)技術(shù)操作復雜，支架材料成本高，不能滿足大規(guī)模的實驗要求。此外，除了微流控芯片技術(shù)及3D生物打印技術(shù)，大部分3D培養(yǎng)技術(shù)無法模擬血管結(jié)構(gòu)，極大限制了神經(jīng)細胞的生長發(fā)育。因此，這些體外培養(yǎng)技術(shù)主要應用于神經(jīng)疾病的早期表現(xiàn)、藥物活性篩選和機制研究，晚期病變及藥物研究大多仍需要動物實驗支持。相信不久的將來，神經(jīng)細胞3D培養(yǎng)技術(shù)會更加完善，這有利于進一步替代傳統(tǒng)的動物體內(nèi)實驗，同時也有利于更深入揭示人類神經(jīng)損傷和神經(jīng)疾病的發(fā)病機制和過程，為神經(jīng)藥物的研發(fā)奠定基礎。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest：All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：關冀弛、陳艷閣、樊雪參與了研究設計；關冀弛、汪海峰、劉丹參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions：The study was designed byGUANJichi,CHENYange, andFANXue.The manuscript was drafted and revised byGUANJichi,WANGHaifeng, andLIUDan.All the authors have read the last version of the paper and consented submission.