劉子瑄 李翠娟 孔馨逸

(1.西京學(xué)院,陜西 西安 710123；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽(yáng) 712046；3.陜西省中醫(yī)體質(zhì)與疾病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046)

體質(zhì)是在先天遺傳和后天獲得因素作用下所形成的人類個(gè)體在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理活動(dòng)方面所固有的、相對(duì)穩(wěn)定的特性。體質(zhì)與疾病之間有著密切的聯(lián)系[1]。小兒體質(zhì)不同于成年人，有其特殊的體質(zhì)特點(diǎn)[2]。

現(xiàn)代學(xué)者對(duì)小兒體質(zhì)的形成因素主要?dú)w納為：先天遺傳和后天因素。先天稟賦是決定與影響小兒體質(zhì)形成和發(fā)展的內(nèi)在原因[3]。張景岳《類經(jīng)》有云：“夫稟賦為胎元之本，精氣之受于父母者是也?！薄队子准伞吩疲骸疤ト跽撸A受于氣之不足也?！笨梢娦律鷥后w質(zhì)強(qiáng)弱，抗病能力強(qiáng)弱主要取決于先天稟賦。先天因素對(duì)小兒體質(zhì)構(gòu)成有著直接影響。《幼科發(fā)揮·胎疾》說：“瘦、長(zhǎng)短、大小、妍媸，皆肖父母也?！闭f明了小兒體質(zhì)與父母體質(zhì)密切相關(guān)。胎兒稟受父母的先天之精，憑借母體的氣血孕育濡養(yǎng)，遺傳父母雙方的體質(zhì)特征[4-6]。說明先天因素對(duì)小兒體質(zhì)的形成有著顯著的影響。

小兒體質(zhì)受稟于先天，培養(yǎng)于后天，影響著疾病的發(fā)生、發(fā)展和病理變化，與疾病的預(yù)防和治療緊密相關(guān)。大量研究證明，體質(zhì)的強(qiáng)弱與免疫功能盛衰密切相關(guān)。本課題通過制作腎虛體質(zhì)小鼠模型，研究探討腎虛體質(zhì)小鼠免疫球蛋白IgG水平及血液生化指標(biāo)的變化，為臨床小兒腎虛體質(zhì)的判斷及腎藏象相關(guān)疾病的防治提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(陜)2018-001，7周BALB/C小鼠24只，雌雄各半，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)。

1.2主要試劑與儀器 ELISA試劑盒(Servicebio)，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force)，渦旋混合器(Servicebio)，超低溫冰箱(海爾)，全自動(dòng)研磨儀(賽維爾生物)，自動(dòng)洗板機(jī)(Rayto)，酶標(biāo)檢測(cè)儀(BioTeK)，水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司)，全自動(dòng)生化分析儀(深圳雷杜生命科技)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物模型的建立與分組 成年BALB/C小鼠24只，雌雄各半，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)1周，雌雄合籠交配，確認(rèn)母鼠受孕后將12只孕鼠隨機(jī)分為兩組，其中6只孕鼠為Ⅰ組，孕期正常喂養(yǎng)，分娩后隨機(jī)抽取10只小鼠作為正常對(duì)照組，雌雄各半。另6只孕鼠為Ⅱ組，從妊娠第2天開始給予恐嚇，每日上午09∶00—11∶00，下午14∶00—16∶00，使用超聲波驅(qū)鼠儀刺激孕鼠，致使其驚恐傷腎，直到小鼠出生后停止恐嚇，使小鼠先天不足，隨機(jī)抽取10只小鼠作為腎虛體質(zhì)組，雌雄各半，觀察各組小鼠一般狀況[7]。

模型特點(diǎn)：先天不足體質(zhì)模型組小鼠在出生時(shí)即表現(xiàn)為體重較輕，身長(zhǎng)較短，易驚等先天不足征象，與先天不足體質(zhì)判斷依據(jù)相符。

2.2取材 造模結(jié)束稱重后，小鼠眼底采血，Eppen-dorf管收集，離心取血清，立即檢測(cè)或于-80 ℃保存待用。

2.3指標(biāo)檢測(cè)及觀察

2.3.1觀察兩組小鼠一般狀況 觀察兩組小鼠形態(tài)、體重、飲食、活動(dòng)能力等情況。

2.3.2各組小鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè) 各組小鼠生化指標(biāo)：鈣、氯、無機(jī)磷、肌酐、尿酸、ALT、AST、ALP、GLU、GSP、TG、TC的檢測(cè)交由武漢賽維爾生物科技有限公司應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2.3.3各組小鼠免疫球蛋白IgG水平檢測(cè) 于武漢賽維爾生物科技有限公司購(gòu)買的Servicebio ELISA試劑盒,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣本濃度。

3 結(jié)果

3.1一般狀況 正常對(duì)照組小鼠皮毛光亮潤(rùn)澤，小鼠反應(yīng)靈敏，飲食、尿量正常，活動(dòng)正常。腎虛體質(zhì)模型組小鼠在出生時(shí)即表現(xiàn)為體積較小，3周后，將母鼠取出，小鼠稱重，腎虛體質(zhì)組小鼠體重明顯輕于正常對(duì)照組小鼠。且身長(zhǎng)相對(duì)較短，毛發(fā)稀疏，膽小易驚，呈蜷縮狀，活動(dòng)量較少，食量較小，與腎虛體質(zhì)判斷依據(jù)相符。

如表1所示，3周時(shí)，與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組的小鼠體重偏低，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 第3周體重比較結(jié)果

3.2各組小鼠血清生化指標(biāo)

3.2.1小鼠血液中鈣、氯、無機(jī)磷的比較 如表2所示，與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組小鼠血液鈣(Ca)濃度有所升高，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；腎虛體質(zhì)組小鼠血液中氯(Cl)及無機(jī)磷(IP)的濃度均呈下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 Ca、Cl、IP測(cè)定情況

3.2.2小鼠血液中肌酐、尿酸的比較 如表3所示，與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組小鼠血液中肌酐(Cr)及尿酸(UA)濃度呈增高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 Cr、UA測(cè)定情況

3.2.3小鼠血液中ALT、AST、ALP的比較 如表4所示，與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組小鼠血液中的ALT、AST濃度均有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腎虛體質(zhì)組小鼠血液ALP(堿性磷酸酶)濃度高于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 ALT、AST、ALP測(cè)定情況

3.2.4小鼠血液中GLU、GSP的比較 如表5顯示，與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組小鼠血液中的葡萄糖(GLU)呈下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腎虛體質(zhì)組小鼠血液中的GSP(果糖胺)呈下降趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 GLU、GSP測(cè)定情況

3.2.5小鼠血液中TG、TC的比較 如表6所示，與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組小鼠血液TG(甘油三酯)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，腎虛體質(zhì)組小鼠血液總膽固醇(TC)呈降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 TG、TC測(cè)定情況

3.3免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果 通過表7可知，免疫球蛋白IgG濃度在正常對(duì)照組和腎虛體質(zhì)組上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，腎虛體質(zhì)組小鼠血液免疫球蛋白IgG濃度低于正常對(duì)照組。

表7 IgG濃度比較結(jié)果

4 討論

體質(zhì)是因臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、陰陽(yáng)等的盛衰偏頗而形成的人體素質(zhì)特征[1]。身體的素質(zhì)特征根據(jù)臟腑氣血陰陽(yáng)的功能狀態(tài)以及邪氣的有無，分為正常體質(zhì)與病理體質(zhì)兩大類[8]。體質(zhì)決定了健康狀況，人體從健康到亞健康再到疾病的發(fā)展過程，關(guān)鍵因素就是體質(zhì)的特征。疾病發(fā)生是以一定的病理體質(zhì)為主要物質(zhì)基礎(chǔ)的，是病癥形成和表現(xiàn)的基礎(chǔ)，具有相關(guān)疾病發(fā)生的傾向性[9]。腎虛體質(zhì)是臨床最常見的病理體質(zhì)類型之一。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，其功能主要有主藏精，主管人體的生長(zhǎng)發(fā)育與生殖，主水，主納氣，在體合骨，生髓通腦，其華在發(fā)，開竅于耳。腎虛體質(zhì)的小兒往往容易出現(xiàn)腎精不足，在嬰幼兒可表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育不良，出現(xiàn)五遲(立、行、齒、發(fā)、語(yǔ)遲)、五軟(頭項(xiàng)軟、口軟、手軟、足軟、肌肉軟)等現(xiàn)象，視為先天不足。先天不足的嬰幼兒往往發(fā)育不良，免疫力低下，自我調(diào)節(jié)能力、適應(yīng)環(huán)境能力和康復(fù)自愈能力都比健康嬰幼兒低下[10]。與健康嬰幼兒相比較，腎虛體質(zhì)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，免疫系統(tǒng)較弱，抗病能力低下。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“氣”是構(gòu)成人體及維持生命活動(dòng)的最基本物質(zhì)，是促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育及抵御外邪的重要因素?！皻狻庇址譃樵?dú)?、宗氣、營(yíng)氣及衛(wèi)氣，其中“衛(wèi)氣”能夠抵抗外邪侵襲，自我調(diào)節(jié)，維持機(jī)體生理功能的穩(wěn)定，促進(jìn)經(jīng)絡(luò)氣血的循行，清除體內(nèi)病原物質(zhì)的作用與免疫系統(tǒng)的功能十分相似[11]。有研究發(fā)現(xiàn)第二道防線中免疫細(xì)胞均由造血干細(xì)胞分化而來，根據(jù)“腎主骨”“藏精”“生髓”理論認(rèn)為“腎骨衛(wèi)氣”參與了體內(nèi)固有免疫反應(yīng)中病原微生物的清除[12]。《靈樞·營(yíng)衛(wèi)生會(huì)》云：“衛(wèi)出于下焦?！敝赋隽诵l(wèi)氣功能與腎藏象密切相關(guān)，那么衛(wèi)氣功能的盛衰與免疫功能的強(qiáng)弱同樣具有密切的聯(lián)系[13]。

新生兒元?dú)馕瓷?，其抗病能力的?qiáng)弱取決于先天稟賦。新生兒主要依靠通過母體胎盤輸入的免疫球蛋白IgG起到免疫保護(hù)作用。IgG是血清中含量最多的一種免疫球蛋白，約占血清總免疫球蛋白量的80%，在免疫系統(tǒng)的防御功能中發(fā)揮著重要作用。未感染其他病原的新生兒體內(nèi)主要的免疫球蛋白就是IgG，可見免疫球蛋白IgG水平的高低可以用來說明新生兒的抗病能力[14]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠血液IgG濃度發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，腎虛體質(zhì)組小鼠血液免疫球蛋白IgG濃度低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有相關(guān)研究表明，慢性腎炎患者，免疫球蛋白IgG的降低是腎陽(yáng)虛的主要表現(xiàn)[15]。李麗華等[16]通過對(duì)100例反復(fù)呼吸道感染氣虛體質(zhì)患兒的免疫球蛋白進(jìn)行檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白IgA、IgG與正常對(duì)照組比較均有一定程度的紊亂。黃曉利等[17]采用四君子湯聯(lián)合穴位按摩法治療呼吸道感染，發(fā)現(xiàn)脾虛患兒治療前后血清IgG水平較治療前顯著升高。譚艷[18]采取中醫(yī)體質(zhì)類型病癥結(jié)合免疫調(diào)節(jié)，治療常見小兒濕疹、蕁麻疹等變態(tài)反應(yīng)性皮膚疾病，通過改善病兒體質(zhì)及免疫功能提高療效。效果顯著，是小兒體質(zhì)學(xué)理論與免疫學(xué)結(jié)合在臨床上的成功運(yùn)用。腎虛體質(zhì)小鼠血液免疫球蛋白IgG濃度發(fā)生了變化，說明腎虛體質(zhì)親代對(duì)子代的免疫球蛋白水平產(chǎn)生了影響，同時(shí)也影響了子代的抗病能力。3周時(shí)各組小鼠體重進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，腎虛體質(zhì)小鼠體重明顯輕于正常對(duì)照組小鼠體重，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。通過觀察發(fā)現(xiàn)腎虛體質(zhì)小鼠身長(zhǎng)相對(duì)較短，毛發(fā)稀疏，膽小易驚，呈蜷縮狀，活動(dòng)量較少，食量較小，與腎虛體質(zhì)判斷依據(jù)相符[19]。說明了親代體質(zhì)特點(diǎn)對(duì)子代體質(zhì)的形成具有重要影響，并進(jìn)一步影響子代生長(zhǎng)發(fā)育及抗病能力。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，腎虛體質(zhì)組小鼠血液ALP、Ca、TG升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。堿性磷酸酶(ALP)的升高是反映小兒發(fā)育不良，佝僂病，軟骨病，黃疸等疾病的重要依據(jù)。甘油三酯(TG)偏高說明其代謝功能失常，往往與甲狀腺功能低下，腎病綜合征等疾病相關(guān)。肌酐、尿酸濃度兩組相比較雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但相較于正常對(duì)照組都呈增高趨勢(shì)。血液肌酐及尿酸濃度可以反映腎小球的濾過功能,肌酐及尿酸呈升高趨勢(shì)表明腎小球過濾功能失常[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎虛體質(zhì)組與正常對(duì)照組小鼠血液中的成分確實(shí)發(fā)生了變化，且與正常對(duì)照組相比較，有顯著差異。證明了親代體質(zhì)特征對(duì)子代鼠體質(zhì)的形成以及對(duì)相關(guān)疾病的易感性有一定的影響。

本實(shí)驗(yàn)利用現(xiàn)代科學(xué)方法，探索了中醫(yī)學(xué)小兒腎虛體質(zhì)的相關(guān)科學(xué)依據(jù)，闡釋了親代體質(zhì)對(duì)子代體質(zhì)形成的先天因素作用的內(nèi)涵，為進(jìn)一步探索中醫(yī)小兒體質(zhì)的現(xiàn)代化研究奠定了基礎(chǔ)。