馮敏 李曉剛 張珍 李艷鵬

(1.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 712000；2.陜西步長高新制藥有限公司，陜西 西安 710119)

潔身洗液[1]是婦科外用洗劑，由苦參、蛇床子、關(guān)黃柏、蒼術(shù)、土荊皮、花椒以及野菊花七味藥材制備而成的中藥制劑。其中，苦參具有清熱解毒，燥濕殺蟲的功效，適用于濕熱蘊(yùn)結(jié)所致濕疹，陰癢帶下[2-15]?？鄥A作為其中的主要有效成分，主要采用高效液相色譜法(HPLC)對苦參堿含量進(jìn)行測定[17-26]。根據(jù)潔身洗液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其苦參堿含量在相鄰批次及同批次穩(wěn)定性中含量測定結(jié)果差異較大，且不同人員操作差異較大，趨勢難以匯總。針對此問題，本文通過研究苦參堿含量測定的影響因素，進(jìn)一步改進(jìn)檢測操作規(guī)程，提高含量測定的準(zhǔn)確性，為該藥物的質(zhì)量控制提供了新的思路及方法。

1 儀器與試劑

1.1儀器及設(shè)備 電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司，HH-4型)、高效液相色譜儀(島津，LC-2010AHT)，酸度計(jì)(美國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，PB-21)。

1.2試劑 鹽酸、三氯甲烷、濃氨試液、磷酸、無水硫酸鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純；無水乙醇、乙腈為色譜純(Thermo-Fisher公司)；精密試紙(pH 8.2～10.0，pH 0.5～5.0，杭州試三科技有限公司)，B-廣泛試紙(pH 1～14，上海三愛思試劑有限公司)。

1.3試藥 含量測定樣品(潔身洗液，批號180401，180402，180403，180404，180405，180406，180601，180602，180603，180701，180702，180703)產(chǎn)自陜西步長高新制藥有限公司；苦參堿對照品(批號：110805-200508，購自中國食品藥品檢定研究院)。

2 測定方法[17]

2.1供試品溶液的制備 精密量取本品10 mL，置分液漏斗中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，用三氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，水液用濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至9～10，用三氯甲烷振搖提取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，加適量無水硫酸鈉脫水，濾過，無水硫酸鈉用三氯甲烷20 mL分?jǐn)?shù)次洗滌，洗液并入濾液中，蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，并用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取苦參堿對照品，加乙腈-無水乙醇(80∶20)制成每1 mL含苦參堿0.15 mg的溶液，即得。

2.3HPLC測定含量 利用HPLC法對苦參堿進(jìn)行檢測，色譜條件為：以氨基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-無水乙醇-3.5%磷酸溶液(78∶10∶12)為流動相；檢測波長220 nm。理論板數(shù)按苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測定。本品每1 mL含苦參以苦參堿計(jì)，不得少于0.20 mg。

3 含量測定的影響因素

由于前期檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其苦參堿含量在相鄰批次及同批次穩(wěn)定性中含量測定結(jié)果差異較大，且不同人員操作差異較大，趨勢難以匯總。故參考《中國藥典》2015版[17]，查找資料，對含量測定方法中的主要影響因素“酸堿度”進(jìn)行了逐步考察。分別針對鹽酸調(diào)pH值、濃氨試液調(diào)pH值兩個步驟，連續(xù)考察三批樣品180401，180402，180403。

3.1用鹽酸調(diào)pH值 分別將供試品溶液調(diào)酸性至pH為0.5、1.0、1.5(分別做平行樣)，用PB-21酸度計(jì)精密調(diào)節(jié)，保持后面堿性pH 9.5相同，置高效液相色譜儀進(jìn)樣檢測，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖1A)表明三個不同酸性的樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異不大，經(jīng)SPSS 20.0分析顯示三組數(shù)據(jù)之間無顯著性差異，因此確定調(diào)酸這一步驟為非主要影響因素。

3.2用濃氨試液調(diào)pH值 分別將供試品溶液調(diào)堿性至pH為9.0、9.5、10.0(分別做3個重復(fù))，用PB-21酸度計(jì)精密調(diào)節(jié)，保持前面酸性pH 1.0相同，用同一高效液相色譜儀在相同條件下檢測。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖1B)表明：一定程度上，苦參堿含量隨著溶液堿性pH的增大而增大，與pH 9.0相比，pH 9.5時含量結(jié)果經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示P值為0.091，二者之間無顯著性差異；pH 10.0時含量結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示P=0.018<0.05有顯著性差異。因此確定調(diào)堿這一步驟為主要影響因素。

圖1 供試品分別在鹽酸調(diào)pH(A)和濃氨試液調(diào)pH(B)時的含量測定

3.3精密試紙調(diào)節(jié) 對當(dāng)月生產(chǎn)的三批潔身洗液180401、180402、180403用精密試紙對調(diào)堿這一步驟進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。前期分別購買了三愛思、新星兩個不同廠家的精密試紙，三批成品分別做平行樣。用精密試紙將酸度調(diào)為1.0，后續(xù)步驟中分別將兩份平行樣一份調(diào)節(jié)堿性至9.0，一份調(diào)節(jié)堿性至9.7，實(shí)驗(yàn)過程中觀察兩個不同廠家精密試紙顏色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)新星廠家試紙顏色較好辨認(rèn)。供試品制備完畢后，測定。

如圖2所示，結(jié)果表明：堿性為9.7時測定的樣品含量高于堿性為9.0時的樣品，經(jīng)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示P=0.001<0.01，二者之間具有較強(qiáng)的顯著性差異。故再次確定調(diào)堿步驟為主要影響因素。通過質(zhì)量風(fēng)險評估，若氨水調(diào)節(jié)pH 9.0含量低，可及時發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量問題，故只降低pH調(diào)節(jié)的最高值。隨即修訂SOP，明確規(guī)定用精密試紙將堿性pH調(diào)至9.0～9.7。

圖2 精密試紙調(diào)節(jié)pH為9.0和9.7時苦參堿的

3.4優(yōu)化前后含量檢測數(shù)據(jù)對比 為進(jìn)一步確定該操作對潔身洗液含量測定的影響，我們選取了接下來生產(chǎn)的數(shù)批潔身洗液用細(xì)化后的操作規(guī)程進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，批號分別為180404，180405，180406，180601，180602，180603，180701，180702，180703。優(yōu)化前后的含量結(jié)果對比，見表1。如表1所示，改進(jìn)前后測定的樣品中苦參堿含量均在標(biāo)準(zhǔn)范圍，改進(jìn)前RSD為15.15%，改進(jìn)后RSD為8.33%，可以看出相鄰批次之間的誤差明顯降低，該結(jié)果表明：細(xì)調(diào)后的操作規(guī)程可以有效地提高批間測量值的重現(xiàn)性，并減少人員操作帶來的個體化差異，使測量結(jié)果更加地準(zhǔn)確。

表1 潔身洗液含量測定方法優(yōu)化前后比較

3.5優(yōu)化后穩(wěn)定性測試 取相同條件下放置的三批潔身洗液，批號分別為180701，180702，180703。按照優(yōu)化后的方法分別制備放置7 d，14 d，21 d的潔身洗液供試品溶液和對照品溶液，利用HPLC進(jìn)樣檢測含量。三批潔身洗液穩(wěn)定性趨勢如圖3，可以看出，細(xì)化后的操作規(guī)程分別測定的三批樣品，同一批樣品之間的含量結(jié)果較為接近，穩(wěn)定性數(shù)據(jù)較為平穩(wěn)，很好的達(dá)到了預(yù)期的執(zhí)行效果。

圖3 三批潔身洗液分別在7、14、21 d的穩(wěn)定性測試

4 結(jié)論

本文改進(jìn)了現(xiàn)有的潔身洗液中苦參堿含量測定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，通過改變氨水調(diào)節(jié)pH值范圍的這一步驟，進(jìn)一步將原來的pH 9.0～10.0縮小至pH 9.0～9.7之間。通過HPLC檢測分析苦參堿含量，發(fā)現(xiàn)相鄰批次之間的含量差異變小，RSD變小，樣品測定的精確度更高。同時，分別檢測放置不同時間的樣品含量的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果數(shù)據(jù)趨于平穩(wěn)。因此，該方法的改進(jìn)有利于提高潔身洗液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，提高樣品檢測的精密度，降低市場風(fēng)險性，同時也可以對其他含有苦參堿中藥制劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。