徐 杰，鐘明利，王躍峰，李 波，韓佳佳，高 雅，張可鋒

(桂林醫(yī)學院，廣西 桂林 541199)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各種病因誘導的慢性肝病所引起的共同病理過程，包括脂肪性肝炎、病毒性肝炎和藥物性肝炎等，是肝臟損傷后在修復過程中的一種代償反應[1]，其主要特點是肝臟受損后，細胞自身修復能力不足，從而導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積及分化為肌成纖維細胞，ECM則主要在活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)中產(chǎn)生，它在HF的致病過程中起關(guān)鍵性作用[2]。HF是一種可逆的創(chuàng)傷愈合過程，但隨病癥的不斷加重，形成難逆性肝硬化，最終導致肝癌，因此尋找有效防治或者緩解HF的治療靶點及藥物，已經(jīng)成為亟待解決的問題[3]。

MAPK信號轉(zhuǎn)導通路主要包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)以及大絲裂原激活蛋白激酶(ERK5/BMK1)4個亞族，其中關(guān)于JNK、p38和ERK的研究較多[4]。JNK是參與生物體內(nèi)各種應激反應的關(guān)鍵分子，p38主要介導炎癥和凋亡相關(guān)通路，ERK則廣泛存在于機體內(nèi)，參與細胞的增殖和分化[5]。研究顯示，在HF發(fā)展過程中，JNK、p38、ERK磷酸化水平升高，治療后則逐漸下降，抑制MAPK信號通路可明顯改善HF[6]。

狗肝菜多糖(dicliptera chinensis polysaccharide，DCP)是爵床科植物狗肝菜Diclipterachinensis(L.)Nees的主要活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),DCP具有抗炎、抗氧化實現(xiàn)保肝作用[7-8]；且發(fā)現(xiàn)DCP能夠通過減少炎癥因子的釋放發(fā)揮抗HF的作用，對DMN誘導的HF具有顯著的緩解作用[9]。綜上所述，MAPK通路與HF的發(fā)生發(fā)展及炎癥反應密切相關(guān)，DCP又可通過減輕炎癥來抑制HF，因此推測DCP抗HF與抑制MAPK通路的激活有關(guān)。故本實驗在前期研究明確DCP抗HF的基礎上，通過觀察DCP對MAPK通路及相關(guān)炎癥因子的影響，探究DCP抗HF的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量(170～210) g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號: SCXK(湘)2015-0010。飼養(yǎng)于濕度40%～55%、溫度(22～26)℃、12 h光暗循環(huán)條件下，自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑2,4-二甲基亞硝胺(2,4-dimethylnitrosamine，DMN)溶液購自天津市化學試劑研究所(批號：010110)；秋水仙堿購自昆明制藥集團股份有限公司(批號：1909A)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、血清堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、總膽紅素(TBIL)試劑盒、透明質(zhì)酸酶(HA)試劑盒、層粘連蛋白(LN)試劑盒、Ⅳ型膠原(IV-C)試劑盒、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號分別為：20190516、20190503、20190428、20190513、20190603、20190610、20190515、20190521)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、Masson染色試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號依次為：MB9898-JUL-13D、MA0123-1-DEC-20D)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自南通市碧云天生物科技研究所(批號依次為：P0013B、P0010S、P0015B)；PVDF膜購自美國Millipor公司(批號：ISEQ00010)；TGF-β1、α-SMA、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK蛋白一抗購自英國Abcam公司(批號依次為：GR121504-3、GR105729-1、ab207477、ab176645、ab278674、ab31828、ab192591、ab32537)；β-actin蛋白一抗購自無錫傲銳東源生物科技有限公司(批號：17AV0305)；山羊抗鼠、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號依次為：112438、133599)。

1.3 儀器ELx800Epoch酶標儀(美國Bio-Tek公司)、CFX96熒光定量PCR(美國Bio-Rad公司)、H2050R臺式高速大容量冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)、OLYMPUS BX51顯微鏡(日本Olmpus公司)、Tanon-4100全自動化學發(fā)光圖像分析檢測系統(tǒng)(上海Tanon公司)。

2 方法

2.1 DCP的制備爵床科狗肝菜Diclipterachinensis(L.) Ness.的全草購自廣西桂林市中藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學藥用植物學教研室韋松基教授鑒定為正品。干燥的狗肝菜全草切碎后于石油醚中回流脫脂2 h，接著沸水提取并濃縮，在4 ℃下用95%酒精醇沉12 h。用Sevag法除去蛋白。抽濾，濾渣依次用乙醚、無水乙醇、丙酮進行洗滌，得狗肝菜粗多糖。將所得物溶于水，于DE52型樹脂層析柱中進行洗脫，真空干燥得淺黃色粉末狀DCP[10]。

2.2 造模及給藥60只大鼠被隨機均分成6組，分別為對照組，模型組，秋水仙堿組(0.2 mg·kg-1)和DCP低、中、高劑量組(DCP100、200、300 mg·kg-1)。除對照組外，其他組均腹腔注射(1.6 mL·kg-1) 0.5% DMN溶液。每周3次，8周末完成造模，對照組被灌胃等體積的生理鹽水。DCP和秋水仙堿用生理鹽水溶解，灌胃給藥，每天(8 mL·kg-1)處理1次，共6周[9]。

2.3 血清、組織樣本收集末次給藥后，用3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，然后收集腹主動脈血液及肝臟。血液經(jīng)離心機離心后得到血清，貯存在-20 ℃冰箱備用。肝組織500 mg按1 ∶9加入枸櫞酸緩沖液，制成10%的肝勻漿液。肝勻漿液離心后得到的上清液放置在-80 ℃冰箱保存。所有大鼠的左葉肝組織被均分為2份，其中1份在同一位置被剪成約1 cm×1 cm大小的肝組織，放置于4%多聚甲醛中固定，肝組織分別用于HE，Masson染色和免疫組化實驗。另1份肝組織放置在-80 ℃被用于RT-PCR 和Western blot實驗。

2.4 血清樣本分析根據(jù)ALT、AST、ALP、TBIL試劑盒說明生化法檢測血清中ALT、AST、ALP的活性和TBIL的含量；同時，嚴格按照HA、LN、IV-C和PCⅢ試劑盒說明書加入血清樣品與相關(guān)工作液，經(jīng)氣浴后，置于酶標儀上，按試劑盒說明書檢測吸光度并計算血清中HA、LN、IV-C和PCⅢ的含量。

2.5 肝臟樣本分析肝臟組織剪碎后，加入相當于肝臟9倍體積的磷酸緩沖液(0.01 mol·L-1，pH7.4)，充分研磨成10%(W/V)勻漿。按照各炎癥因子ELISA試劑盒說明書測量肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

2.6 肝臟病理切片檢查

2.6.1 HE染色和Masson染色 大鼠的肝組織固定48 h后，在不同濃度的乙醇和二甲苯進行脫水。脫水后的肝組織用石蠟包埋機包埋成肝組織蠟塊。然后將肝組織蠟塊切成4 μm的切片。按照HE和Masson染色方法對肝組織切片進行染色。置于光學顯微鏡下，觀察肝組織病理變化并拍攝收集圖片。

2.6.2免疫組化 將制備好的組織切片于70 ℃中放置30 min，再置二甲苯中10 min脫蠟。首先將切片置于乙醇中脫水，接著用枸櫞酸鈉抗原修復液進行抗原修復，冷卻至室溫，再依次使用過氧化氫和牛血清白蛋白。分別孵育一抗a-SMA(1 ∶200)和TGF-β1(1 ∶500)12 h，和山羊抗兔IgG二抗(1 ∶100)30 min。最后，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)浸泡5 min著色，用蘇木精復染，觀察表達結(jié)果并拍攝收集圖片。

2.7 實時熒光定量PCR在各實驗組肝臟中加入TRIzol試劑，裂解后得到總RNA。按說明書操作，總RNA被反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板在CFX96熒光定量PCR儀上根據(jù)檢測試劑盒反應條件進行擴增。擴增條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。依據(jù)Ct值計算2-ΔΔCt，以β-actin為參照，計算相對表達量(Tab 1)。

Tab1 Information of primer sequences

2.8 Western blot分析在各實驗組肝臟中加入1%的PMSF的RIPA緩沖液，裂解后得到總蛋白。按照BCA擔保測定試劑盒說明書檢測總蛋白濃度?？偟鞍字屑尤氲鞍咨蠘泳彌_液，于95 ℃水浴5 min變性蛋白質(zhì)。用10%SDS-PAGE分離變性蛋白質(zhì)，冰浴條件下以恒轉(zhuǎn)電流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，于室溫下?lián)u床封閉封閉2 h，TBST洗膜后分別于以下抗體4 ℃搖床孵育過夜：JNK(1 ∶1 000)，p38(1 ∶1 000)，ERK(1 ∶1 000)，p-JNK(1 ∶1 000)，p-p38(1 ∶1 000)，p-ERK (1 ∶1 000)，β-actin(1 ∶1 000)。次日，TBST洗膜后加入山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h。將PVDF膜置于全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中，使用Image軟件分析條帶蛋白灰度，以β-actin為參照，計算蛋白相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 DCP對HF大鼠肝組織病理形態(tài)學的影響對照組大鼠肝臟呈鮮紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟且有彈性；模型組肝臟呈暗紅色和灰白色相間，表面粗糙，質(zhì)地較硬且邊緣變厚；給藥組肝臟病變程度較模型組均有改善，其中DCP高劑量組對組織形態(tài)改善程度最大。

進一步HE染色和Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊,且以中央靜脈為中心呈現(xiàn)放射狀、無明顯炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝細胞排列分布紊亂，出現(xiàn)大量藍色膠原纖維沉積，被沉積的膠原纖維分割成大小不等的假小葉，出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤和肝細胞壞死；與模型組相比，各給藥組受損的肝小葉結(jié)構(gòu)減輕，亦有不同程度的膠原纖維沉積，炎性細胞浸潤減少，其中DCP高劑量組改善程度最大(Fig 1)。

Fig 1 Effect of DCP on liver appearance and pathological changes of rats(×200)

3.2 DCP對HF大鼠肝功能的影響觀察血清生化指標，模型組大鼠肝細胞產(chǎn)生大量ALT、AST、ALP，顯示肝細胞嚴重受損，TBIL的顯著升高說明大鼠肝臟攝取和排泄功能出現(xiàn)障礙，以上各指標與對照組相比具有明顯差異(P<0.01)；各給藥組與模型組相比，ALT、AST、ALP、TBIL均有不同程度的下降(P<0.01)，其中DCP高劑量組改善程度最明顯(Fig 2)。

Fig 2 Effect of DCP on liver function of rats

3.3 DCP對HF大鼠血清HA、LN、IV-C和PCⅢ含量的影響肝纖維化4項(HA、LN、IV-C和PCⅢ)指標常用來作為判斷HF病情發(fā)展情況和治療效果，與對照組相比，模型組大鼠肝纖維化四項指標均上升(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組肝纖維化四項指標均有不同程度的下降(P<0.01),其中DCP高劑量組改善程度最為明顯(Fig 3)。

Fig 3 Effect of DCP on four indexes of liver fibrosis in rats

3.4 DCP對HF大鼠肝組織α-SMA、TGF-β1、TNF-α、IL-6、IL-1β表達的影響免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織中TGF-β1、α-SMA、表達明顯增加，與模型組相比，各給藥組肝組織中TGF-β1、α-SMA表達明顯降低，其中DCP高劑量組降低程度最為明顯；ELISA及RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達明顯降低(P<0.01)，其中DCP高劑量組降低程度最為明顯(Fig 4,5)。

Fig 4 Effect of DCP on TGF-β1 and α-SMA of liver in rats (×200)

Fig 5 Effect of DCP on inflammatory cytokines of liver in rats

3.5 DCP對HF大鼠MAPK信號通路的影響Western blot實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠p-JNK、p-p38、p-ERK蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.01)。與模型組相比，DCP干預后，肝組織中MAPK通路相關(guān)蛋白的表達具有不同程度的降低(P<0.01)，其中DCP高劑量組改善程度最為明顯(Fig 6)。

Fig 6 Effect of DCP on MAPK pathway

4 討論

本實驗采用的DMN誘導大鼠HF模型，其造模原理是DMN進入肝細胞代謝成乙醛，乙醛引起肝細胞損傷，同時生成的甲基使核酸、蛋白質(zhì)甲基化導致肝壞死，因其造模時間短、重復性高等特點被作為研究抗HF的首選模型[11]。因此本研究選該造模方法。

當肝臟受損時，由于細胞膜的通透性改變，使位于肝細胞內(nèi)的ALT、AST、ALP、TBIL溢出進入血液，因此ALT、AST、ALP、TBIL被認為是臨床判斷肝損傷的重要指標[12]。當肝臟出現(xiàn)纖維化樣病變時，HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C隨HF的加重不斷升高，因此HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C可作為臨床判斷HF病情發(fā)展情況和治療效果的重要指標[13]。在本次實驗中，用DMN處理后的大鼠，肝組織結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，膠原纖維過度積累，并引起血清中ALT、AST、ALP、TBIL、HA、LN、PC-Ⅲ和Ⅳ-C活性或含量的顯著增加，以上指標表明HF動物模型的成功建立。經(jīng)DCP干預，發(fā)現(xiàn)不同劑量DCP可以減輕DMN對肝臟造成的肝損傷，減少膠原沉積，表明DCP可減緩DMN誘導的HF進程。

α-SMA在HF過程中起重要作用，能反映HSC細胞的活化水平[14]。TGF-β1則貫穿HF始終，其可通過不斷刺激HSC的激活加重HF病癥[15]。研究表明，TNF-α是調(diào)節(jié)HF的重要因素之一，IL-6和IL-1β是具有炎癥介質(zhì)作用的多功能細胞因子，這3個炎癥因子的表達對于HF的發(fā)展進程具有重要影響[16]；在機體各種纖維化的發(fā)展過程中，MAPK信號通路蛋白的表達情況和變化趨勢與HF和炎癥反應的變化趨勢一致[17]。JNK是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)周期、凋亡、應激的關(guān)鍵分子，參與細胞內(nèi)的各種應激反應，能夠活化HSC細胞的增殖；p38主要調(diào)節(jié)抗炎和致炎方面的平衡，影響炎癥反應的過程，對HSC的增殖具有影響作用；ERK則屬于MAPK的經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導途徑，機體內(nèi)許多因子的受體都是由ERK的活化來達到信號轉(zhuǎn)導的目的，在HSC的增殖中起到調(diào)節(jié)作用[18]。因此，抑制MAPK相關(guān)通路的激活可作為緩解HF的有效作用靶點。本研究顯示，DCP可明顯下調(diào)α-SMA、TGF-β1、TNF-α、IL-6和IL-1β，抑制MAPK通路被激活，從而有效改善HF病變。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，DCP具有減輕DMN所誘導的大鼠肝纖維化作用，其機制可能與抑制TGF-β1的表達、抑制MAPK通路及降低炎癥因子的釋放有關(guān)。由于肝纖維化疾病的病因復雜、致病因素多、涉及的細胞信號通路廣泛，因此，DCP抗HF的詳盡分子作用機制接下來將繼續(xù)深入。本文研究結(jié)果進一步為證實DCP抗HF療效確切，為將其開發(fā)為臨床保肝藥物提供實驗基礎。