再努熱·阿不拉汗 熱迪娜·亞生 韓 晶

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)科，烏魯木齊市 833000，電子郵箱：C13989508@163.com)

近年來，缺血性腦卒中已成為我國居民死亡的主要原因之一[1]。大腦中動脈缺血會影響腦組織的血液循環(huán)，使得腦組織的氧氣和葡萄糖供給不足。由于腦組織的高能耗性與易損性，較長時間的血氧剝奪會導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)損傷[2]。目前，溶栓治療是缺血性腦卒中的首選治療方案，然而較短的治療時間窗及較危險的副作用限制了溶栓治療的應(yīng)用[3]。因此，亟須探尋預(yù)防缺血性腦卒中的發(fā)生或減輕缺血性腦卒中后的腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙的有效措施。

已有較多文獻報告，缺血性腦卒中后長期運動有助于患者康復(fù)，其機制包括抑制小膠質(zhì)細胞活化從而減少炎癥反應(yīng)[4-5]，增加神經(jīng)保護因子的分泌從而促進神經(jīng)元新生[6]，以及減少神經(jīng)元凋亡從而緩解血腦屏障破壞[7]。然而，發(fā)病前長期運動是否有助于改善缺血性腦卒中后的腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙，其機制是否與降低小膠質(zhì)細胞活化相關(guān)，卻鮮有研究報告。因此，本研究擬采用跑步與游泳強迫大鼠鍛煉，再通過線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中模型，探究長期運動預(yù)處理對缺血性腦卒中后腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙的改善作用及其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10周齡成年雄性SD大鼠36只，清潔級，體質(zhì)量(230±10)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2018-0001]。飼養(yǎng)環(huán)境：相對濕度(60±5)%，室內(nèi)溫度(24±2)℃，噪聲小于50 dB，正常晝夜交換節(jié)律，室內(nèi)通風(fēng)良好，充足的食物與水源，為了保證大鼠有充足的自主活動空間，每籠大鼠不多于4只。根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、腦缺血組、運動+腦缺血組，每組12只。

1.2 實驗材料 L3400線栓購自廣州佳靈生物技術(shù)公司，抗兔離子化鈣結(jié)合適配分子1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)抗體(批號：bs-718240)、抗小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)抗體(批號：bs-709432)、抗小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)抗體(批號：bs-758321)、抗兔白細胞介素(interleukin,IL)-6抗體(批號：bs-795843)、抗兔IL-1β抗體(批號：bs-712183)、抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(批號：bs-728732)均購自北京博奧森公司；酶標山羊抗鼠Ig(H+L)抗體(批號：65-19-768)、RIPA裂解液(批號：7018-905)購自上海碧云天公司；氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)(批號：80417-793)、免疫組化試劑盒(批號：60029-132)均購自北京索萊寶公司。

1.3 長期運動方案 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，運動+腦缺血組大鼠開始連續(xù)4周的運動訓(xùn)練。每天上午，將大鼠放到自動跑步機(上海玉研儀器公司，型號：IITC Model 800)上跑步。設(shè)置動物程序為：由10 m/min至25 m/min緩慢提速，然后再緩慢降速，升速、降速的加速度均為1 m/min2，跑步時間共30 min；跑步機尾部設(shè)置電擊以刺激大鼠向前跑步，電流強度為1.0 mA。每天下午，將大鼠投入一個裝滿水的圓柱形水桶(直徑1.6 m，水高0.4 m)中，進行游泳運動，設(shè)置水溫為(24±1)℃，15 min/次。在運動+腦缺血組大鼠進行強迫鍛煉時，將其他兩組大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的曠場中自由活動。所有大鼠均連續(xù)運動或活動4周。

1.4 腦缺血模型的構(gòu)建方法 運動干預(yù)結(jié)束后，參考文獻[8]中的方法建立腦缺血模型。取腦缺血組和運動+腦缺血組大鼠，術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)進行麻醉，以按壓腳趾無反應(yīng)為麻醉成功標準。將大鼠以仰臥位固定于手術(shù)臺上，給予頸部正中區(qū)域消毒后剃毛，使用手術(shù)刀片做一約1.5 cm的縱向切口，沿肌肉組織向下分離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端和頸外動脈遠心端，止血鉗夾閉頸內(nèi)動脈。頸總動脈剪開一個小口，插入線栓，松開止血鉗，沿頸內(nèi)動脈前進至大腦中動脈，進入距離分叉處15～17 mm，封閉大腦中動脈血流。固定線栓，維持2 h。再次注射少量戊巴比妥鈉維持麻醉狀態(tài)，輔助拔出線栓并結(jié)扎頸總動脈避免出血，縫合傷口，放入鼠籠中。按照上述的方法，給予假手術(shù)組大鼠麻醉、頸部消毒后做切口，分離出頸動脈后縫合傷口。建立腦缺血模型的大鼠于術(shù)后2～3 h順利蘇醒，腦缺血區(qū)所支配的對側(cè)前肢無法伸展，按壓時反應(yīng)遲鈍，提示造模成功。如出現(xiàn)大鼠死亡情況，則補充至每組12只。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分 拔出線栓24 h后，參考Zea Longa 5分制標準[8]對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分(假手術(shù)組同一時間點進行評分)。評分標準：0分，四肢正常，可自由行走；1分，大鼠可正常行走，但提起大鼠懸空時，大鼠右側(cè)前肢無法完全伸展，呈屈曲、抬高、肩內(nèi)收；2分，在1分表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，存在向前癱瘓且有右側(cè)旋轉(zhuǎn)行走征象；3分，在2分表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)側(cè)推易跌倒，行走較為困難；4分，大鼠無法自主活動，癱瘓且部分意識喪失。

1.6 腦水腫程度的評估 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，迅速斷頭。完整取出大鼠腦組織，去除多余組織，吸干表面水分，電子秤稱量大腦質(zhì)量，記為濕重；將腦組織放入105℃烘箱中干燥去濕，6 h后稱重，之后每隔1 h稱一次質(zhì)量，當連續(xù)稱重3次前后差值少于0.3 mg時則記錄最后一次質(zhì)量為干重。根據(jù)公式計算得腦水腫程度，即[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.7 TTC染色法評估腦梗死體積 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，迅速斷頭。將腦組織取出后，置于-20℃冰箱中冷凍30 min，當腦組織僵硬且易于切片時取出。使用鋒利的刀片將腦組織自距額極約4 mm外作連續(xù)的冠狀切片，每片厚度約3 mm，約5片。將切片浸泡于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育20 min，每4 min翻動一次切片。將TTC溶液傾去，加入4%多聚甲醛溶液進行固定，30 min后將腦組織切片按順序一次排列，使用數(shù)碼攝像機拍攝。正常腦組織被TTC溶液染成玫瑰紅色，梗死區(qū)域著色為白色。利用Image-Pro Plus軟件測量腦組織切片白色區(qū)域面積，并計算腦梗死體積，以梗死體積占全腦體積百分比來表示腦梗死程度。

1.8 免疫組化染色檢測Iba1和TLR4的表達情況 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，剪開胸骨，暴露胸腔。使用生理鹽水灌注沖盡血液，再以4%多聚甲醛灌注固定組織。斷頭取腦，將腦組織放入4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定3 d。取出腦組織，梯度乙醇脫水，對腦組織進行石蠟包埋，然后將石蠟包埋組織切成約4 μm厚的切片。將切好的石蠟切片放于45℃溫水中展開，移至玻片上鋪平，60℃烤片100 min。切片上滴加1%牛血清蛋白封閉液，室溫封閉2 h，磷酸緩沖鹽溶液漂洗玻片3次，切片上滴加抗兔Iba1單克隆抗體(1 ∶200)與抗小鼠TLR4單克隆抗體稀釋液(1 ∶200)，并在4℃條件下孵育過夜。次日，取出腦組織切片，磷酸緩沖鹽溶液漂洗玻片3次，滴加酶標山羊抗鼠Ig(H+L)抗體稀釋液(1 ∶200)，24℃條件下孵育2 h。磷酸緩沖鹽溶液洗滌玻片3次，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺底物復(fù)合物中孵育顯色3～15 min，雙蒸水充分沖洗，蘇木精復(fù)染20 s，然后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片，重點觀察缺血側(cè)海馬區(qū)與前額皮層區(qū)?？梢娮攸S色顆粒則判定為樣本陽性表達，通過軟件Image-Pro Plus 6.0測定陽性表達區(qū)的光度值，以假手術(shù)組樣本光度值的平均值為基值進行歸一化統(tǒng)計。

1.9 免疫印跡試驗檢測炎性因子的蛋白表達情況 神經(jīng)功能評分完成后，采用隨機數(shù)字法每組選取3只大鼠，過量麻醉致死(3%戊巴比妥鈉，0.2 mL/100 g，腹腔注射)，迅速斷頭。取出腦組織后，鑷取缺血側(cè)海馬組織與皮層組織部位，稱重質(zhì)量后加入RIPA裂解液提取總蛋白，裂解液與組織體積質(zhì)量比為4 ∶1。將海馬組織或皮層組織研磨成細胞懸液，4℃冰箱中靜置30 min以充分提取蛋白。12 000 r/min離心30 min，吸取上清液，加入上樣緩沖液，沸水中煮10 min使蛋白變性。配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，取出上樣梳，每孔加入約10 μg樣品進行電泳。設(shè)置電泳條件為恒壓30 V/30 min、90 V/90 min，整個電泳以上樣緩沖液到達凝膠底部設(shè)為電泳終點。根據(jù)分子標記Marker截取目的蛋白凝膠條帶，使用濕法轉(zhuǎn)膜法將目的蛋白自凝膠條帶上轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件為恒流2 mA，時間60 min，整個轉(zhuǎn)膜過程保持冰水浴。取出聚偏二氟乙烯膜，浸沒于4%脫脂奶粉溶液中，封閉2 h，避免抗原與抗體非特異性結(jié)合。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌聚偏二氟乙烯膜，分別加入一抗稀釋液，包括抗小鼠TNF-α抗體(1 ∶1 000)、抗兔IL-6抗體(1 ∶1 000)、抗兔IL-1β抗體(1 ∶1 000)、抗小鼠GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4℃條件下孵育過夜。次日，取出聚偏二氟乙烯膜，磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠IgG(H+L)二抗稀釋液(1 ∶2 000)，室溫條件避光孵育2 h。磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，于條帶上滴加ECL超敏發(fā)光液，顯影儀下顯影，使用Image J圖像分析軟件獲取蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad 7.0軟件進行繪圖。計量資料以(x±s)表示，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差進行比較，應(yīng)用Tukey檢驗法進行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 長期運動對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能的影響 假手術(shù)組大鼠沒有出現(xiàn)任何行為學(xué)異常，能夠自由行走且活躍度較高；腦缺血組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，主要表現(xiàn)為行動遲緩，右側(cè)前肢無法完全伸直，且僅能向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，部分大鼠側(cè)推易跌倒；運動+腦缺血組大鼠主要表現(xiàn)為一側(cè)前肢無法伸展，但行動活躍且平衡能力較強，神經(jīng)功能障礙較腦缺血組改善。3組大鼠神經(jīng)功能評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，腦缺血組、運動+腦缺血組、假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分依次降低(均P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損評分的比較(x±s，分)

2.2 長期運動對大鼠腦缺血后腦水腫和腦梗死程度的影響 腦缺血組和運動+腦缺血組大鼠腦組織水腫程度較假手術(shù)組嚴重，但運動+腦缺血組大鼠腦組織水腫程度較腦缺血組減輕(均P<0.05)，見表2。假手術(shù)組腦組織TTC染色為紅色，腦缺血組和運動+腦缺血組大鼠腦組織出現(xiàn)不同程度的白色梗死區(qū)域，腦梗死程度均較假手術(shù)組嚴重，但運動+腦缺血組大鼠腦梗死程度較腦缺血組減輕(均P<0.05)，見表2和圖1。

表2 3組大鼠腦水腫和腦梗死程度的比較(x±s，%)

圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)域

2.3 長期運動對大鼠腦缺血后腦組織中Iba1和TLR4表達的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬區(qū)與前額皮層中Iba1和TLR4的表達量均增加(均P<0.05)；與腦缺血組相比，運動+腦缺血組海馬區(qū)與前額皮層中Iba1和TLR4的表達量均降低(均P<0.05)。見表3和圖2、圖3。

表3 3組大鼠腦組織中Iba1和TLR4相對表達量的比較(x±s)

圖2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)與前額皮層中Iba1表達水平(免疫組化染色，×20)

圖3 各組大鼠腦組織海馬區(qū)與前額皮層中TLR4表達水平(免疫組化染色，×20)

2.4 長期運動對大鼠腦缺血后腦組織中促炎性細胞因子蛋白表達的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠海馬區(qū)與前額皮層中TNF-α、IL-1β與IL-6的蛋白相對表達量均增加(均P<0.05)；與腦缺血組相比，運動+腦缺血組大鼠海馬區(qū)與前額皮層中TNF-α、IL-1β與IL-6的蛋白相對表達量均降低(均P<0.05)。見表4、圖4、圖5。

表4 3組大鼠腦組織中促炎性細胞因子蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖4 各組(各2只)大鼠海馬組織中促炎性細胞因子的蛋白表達情況

圖5 各組(各2只)大鼠前額皮層組織中促炎性細胞因子的蛋白表達情況

3 討 論

缺血性腦卒中是全球性的公共衛(wèi)生問題，其高致殘率和高致死率與缺血性腦損傷的嚴重程度密切相關(guān)[9]。缺血性腦卒中的病理機制非常復(fù)雜，涉及多種因素，如神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)元再生抑制等[10]。其中，小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了該病發(fā)生與進展的整個過程，是影響缺血性腦卒中患者預(yù)后的重要因素之一[11]。

已有較多文獻報告，缺血性腦卒中發(fā)病后進行長期運動可發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護作用[4-6]。在臨床中，長期輔助運動是腦卒中患者康復(fù)管理的重要措施之一[12]。然而，發(fā)病前長期運動對減輕缺血性腦卒中發(fā)生后神經(jīng)功能障礙的作用及其機制鮮有研究報告。本研究首先強迫大鼠進行為期4周的跑步、游泳混合鍛煉，然后采用線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中模型，在建模24 h后評估大鼠的神經(jīng)功能、腦水腫程度與腦梗死體積。本研究結(jié)果表明，運動預(yù)處理能改善缺血性腦卒中引起的腦水腫與腦組織梗死，降低神經(jīng)功能評分。不同負荷運動會誘導(dǎo)腦組織出現(xiàn)間歇性缺血缺氧狀態(tài)，這種短暫、高頻的生理缺血能夠提高人體血氧重新分配能力，提高機體的抗缺血缺氧能力，增強腦組織自我保護能力[13]。因此，缺血前長期運動本質(zhì)上是通過一定的刺激手段，誘發(fā)機體內(nèi)源性自我保護反應(yīng)，從而快速適應(yīng)缺血再灌注的刺激，及時做出反應(yīng),保護腦功能。

IL-1β，IL-6與TNF-α是缺血性腦卒中領(lǐng)域中被廣泛研究的促炎性細胞因子。這3種細胞因子主要是由活化的小膠質(zhì)細胞分泌，在缺血性腦卒中的進展中扮演重要角色[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，給予能夠?qū)笽L-1β與TNF-α的中和抗體進行預(yù)處理，能有效縮小缺血性腦卒中小鼠的腦梗死體積[15]。此外，紋狀體內(nèi)注射外源性重組IL-1β則會加劇缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷[16]。IL-6是一種多效促炎性細胞因子，在缺血性腦卒中中IL-6的作用仍存在爭議。Loddick等[17]發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射外源性重組IL-6可以顯著降低大鼠腦缺血再灌注后腦水腫程度，部分恢復(fù)大鼠的神經(jīng)功能。但多數(shù)研究報告IL-6表達降低在缺血性腦卒中模型中發(fā)揮著強大的神經(jīng)保護作用[18]。本研究中，腦缺血組大鼠腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白相對表達量均較假手術(shù)組增加(均P<0.05)，提示IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高在急性缺血性腦卒中的發(fā)生中具有重要作用；而運動+腦缺血組大鼠腦組織中上述因子的蛋白相對表達量均較腦缺血組降低(均P<0.05)，表明長期運動可有效地降低缺血性腦卒中后大鼠腦組織中促炎因子的表達。

促炎性細胞因子在缺血性腦卒中進展中扮演重要角色，而小膠質(zhì)細胞快速激活是誘發(fā)炎癥的關(guān)鍵反應(yīng)[19]。靜息狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞通過較長突觸對腦實質(zhì)起監(jiān)視作用；當發(fā)生血氧供應(yīng)不足時，小膠質(zhì)細胞迅速進入活化狀態(tài)，吞噬壞死細胞，釋放出大量促炎性細胞因子誘發(fā)腦組織炎癥反應(yīng)[20]。小膠質(zhì)細胞激活對于宿主防御、清除碎片和組織修復(fù)是必需的，但小膠質(zhì)細胞的過度激活會分泌各種細胞因子來殺死其他細胞，這進一步加重了缺氧條件下的腦組織損傷[21]。因此，靶向抑制小膠質(zhì)細胞過度活化已成為缺血性腦卒中的治療策略。TLR4是小膠質(zhì)細胞膜上一種重要的模式識別受體，在與配體結(jié)合時會使小膠質(zhì)細胞活化，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[22]。而Iba1則是小膠質(zhì)細胞的特異性識別抗體，在小膠質(zhì)細胞過度活化時會過度表達[23]。因此，TLR4與Iba1的表達共同反映了小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)，兩者的表達隨著小膠質(zhì)細胞的活化而增加。本研究中，中動脈缺血造成了TLR4與Iba1表達協(xié)同增加;然而，模型構(gòu)建前長期運動顯著地逆轉(zhuǎn)了缺血性腦卒中介導(dǎo)的TLR4表達增加，降低了小膠質(zhì)細胞活化指標Iba1的表達。由此推測，長期運動可通過抑制由小膠質(zhì)細胞活化引起的炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，發(fā)病前的長期運動有助于減輕缺血性腦卒中后大鼠的腦水腫和腦梗死程度，改善神經(jīng)功能障礙，其機制可能與抑制小膠質(zhì)細胞激活引起的炎癥反應(yīng)相關(guān)。因此，對于缺血性腦卒中的高發(fā)人群，如糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化患者[24]，或者常飲酒、血壓、血脂較高的老齡人群[25]，應(yīng)鼓勵其加強體育鍛煉，以減輕缺血性腦卒中后的腦組織損傷和神經(jīng)功能損傷。