吳 進 王振輝 李 慧 肖 凱 王 芳 吳 佳

(湖南省婦幼保健院藥學(xué)研究部，長沙市 410008，電子郵箱：wuon4616@163.com)

抑郁癥是一種較為常見的精神障礙疾病，主要表現(xiàn)為情緒低落、焦慮、精力不集中、失眠等。中國現(xiàn)有抑郁癥患者超過9 500萬[1-2]，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告,抑郁已成為中國疾病負(fù)擔(dān)第二順位，預(yù)計2030年將上升至世界疾病負(fù)擔(dān)首位[3]，這將給社會帶來巨大的經(jīng)濟壓力。但抑郁癥存在致病因素復(fù)雜、發(fā)病機制尚不清楚、臨床治愈率低等問題。有研究表明，鹽酸小檗堿單獨使用或者聯(lián)合抗抑郁藥物使用能夠改善患者的抑郁情況[4-5]；在臨床工作中筆者也發(fā)現(xiàn)，服用鹽酸小檗堿的患者，其抑郁癥狀得到相應(yīng)的改善。但鹽酸小檗堿干預(yù)抑郁的作用機制還不甚明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計算機虛擬運算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索為一體的新型學(xué)科，其可以將某些藥物和相關(guān)疾病緊密聯(lián)系起來，建立“藥物-靶點-疾病”多層次的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可幫助學(xué)者從系統(tǒng)和整體的角度預(yù)測和闡明藥物作用靶點及其潛在的作用機制，為藥物研究者提供新的思路和技術(shù)手段。故本研究從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討鹽酸小檗堿治療抑郁癥的作用機制，為進一步推廣鹽酸小檗堿的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 鹽酸小檗堿靶點的篩選及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)檢索鹽酸小檗堿的作用靶點[6]；同時獲得鹽酸小檗堿化學(xué)結(jié)構(gòu)的mol2格式文件，將mol2格式文件上傳至PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitjob.html)進行靶點預(yù)測[7]并獲取前300個靶點(根據(jù)Maximum Generated Conformations排序篩選)的名稱等信息。通過Excel軟件對TCMSP數(shù)據(jù)庫和PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲得的靶點進行合并、去重后，將靶點信息輸入UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中進行檢索、校正，刪除不規(guī)范及重復(fù)靶點，得到小檗堿的作用靶點[8]。將小檗堿的作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)，選定物種為人，構(gòu)建與靶點有相互作用的蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)，以獲得更多鹽酸小檗堿的潛在作用靶點；導(dǎo)出小檗堿潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)文件，使用Cytoscape 3.5.1(http://www.cytoscape.org/)進行可視化分析[9]；然后對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進行分析，以中介中心度(betweenness centrality,BC)、鄰近中心度(closeness centrality,CC)和度值(Degree)大于平均數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選鹽酸小檗堿的核心潛在作用靶點。

1.2 抑郁癥相關(guān)靶點的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中，以“depression”“depressive” “antidepressant”為關(guān)鍵詞進行檢索[10]，獲得抑郁癥的相關(guān)靶點。

1.3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在靶點的確認(rèn)及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Excel軟件對1.1獲得的小檗堿相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)中的靶點與1.2獲得的疾病相關(guān)靶點，得到鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點，按照1.1的方法構(gòu)建小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進行分析，以BC、CC、度值均大于平均值獲得小檗堿治療抑郁癥的核心潛在作用靶點。

1.4 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的富集分析 利用生物信息學(xué)注釋數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[11]對獲得的鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，采用Bonferroni法校正后，以P<0.01的項目為顯著富集[12-13]。

2 結(jié) 果

2.1 鹽酸小檗堿的作用靶點 TCMSP共檢索到鹽酸小檗堿靶點29個，將其與PharmMapper預(yù)測的300個鹽酸小檗堿靶點進行合并、去重，選定物種為人，共得到鹽酸小檗堿的潛在作用靶點218個。將這218個靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與其有相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)，從網(wǎng)絡(luò)中共獲得267個鹽酸小檗堿的潛在作用靶點，見圖1；運用Cytoscape軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化，對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示BC、CC和度值的平均值分別為0.010 5、0.334 8和8.29，且BC、 CC和度值均大于平均數(shù)的靶點共有42個(見表1)，即為鹽酸小檗堿的核心潛在作用靶點。

圖1 鹽酸小檗堿潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

表1 鹽酸小檗堿的核心潛在作用靶點

2.2 鹽酸小檗堿治療抑郁癥的作用靶點 在GeneCards網(wǎng)站中共檢索到抑郁癥相關(guān)靶點14 271個，將其與267個鹽酸小檗堿的潛在作用靶點取交集后，得到184個鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點，見圖2。將這184個鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫后，運用Cytoscape軟件構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)，對網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示BC、 CC和度值的平均值分別為0.010 1、0.382 4和11.73；BC、 CC和度值均大于平均數(shù)的靶點共有35個，即為鹽酸小檗堿治療抑郁的核心潛在作用靶點(見表2)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果，在表1和表2中，BC、 CC和度值排名均位于前10的靶點共有7個，分別是白蛋白(albumin，ALB)、熱激蛋白90αA1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90αA1)、細(xì)胞色素C(cytochrome C,somatic，CYCS)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)。

圖2 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的韋恩圖

圖3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 鹽酸小檗堿治療抑郁癥的核心潛在作用靶點

2.3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的富集分析 將得到的184個鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。最終共得到184個GO生物學(xué)過程，其中G1/S有絲分裂細(xì)胞周期、對藥物的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、DNA復(fù)制、對雌二醇的反應(yīng)、對雌激素的反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、積極調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖、積極調(diào)控細(xì)胞增殖、肽絲氨酸磷酸化、有絲分裂細(xì)胞周期檢查點、細(xì)胞分裂、氧氣運輸?shù)?4個生物學(xué)過程具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點涉及的KEGG富集通路共45個，其中細(xì)胞周期、p53信號通路、叉頭框蛋白O(forkhead box O,FoxO)信號通路、催乳素信號通路、抗生素的生物合成、精氨酸生物合成、氨基酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等18個KEGG信號通路具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表3 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的GO功能富集分析結(jié)果

表4 鹽酸小檗堿治療抑郁癥潛在作用靶點的KEGG富集分析結(jié)果

3 討 論

已有學(xué)者報告，鹽酸小檗堿能夠改善腸易激綜合征患者的焦慮癥狀[3]；對于既往經(jīng)三環(huán)類抗抑郁藥及5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑系統(tǒng)治療但癥狀改善不理想的重度抑郁障礙患者，聯(lián)合小檗堿治療后，抑郁癥狀和軀體疼痛相關(guān)癥狀可獲得顯著改善[14]；鹽酸小檗堿聯(lián)合艾司西酞普蘭能夠改善老年抑郁癥患者的睡眠障礙，并顯著降低漢密爾頓抑郁量表評分[4]。在動物實驗中，不同學(xué)者均發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能夠改善小鼠的抑郁樣行為[15-17]，說明小檗堿有一定的抗抑郁作用[18]。

我們將鹽酸小檗堿的潛在作用靶點與抑郁癥相關(guān)靶點進行對比并取交集，得到鹽酸小檗堿治療抑郁癥的潛在作用靶點共184個。利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape軟件進行分析后發(fā)現(xiàn)，ALB、HSP90αA1、CYCS、ESR1、CDK2等靶點較為重要。徐靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者體內(nèi)血清ALB水平與漢密爾頓抑郁量表評分呈負(fù)相關(guān)，其機制可能與抑郁癥患者體內(nèi)普遍存在炎癥相關(guān)因子，并伴有炎癥反應(yīng)激活，而炎癥相關(guān)因子可促使胰島素樣生長因子1大量分解，進而抑制肝臟蛋白合成有關(guān)[20]。韋玨伶等[21]發(fā)現(xiàn)中重度抑郁組肝癌患者HSP90αA1/HSPA8的表達顯著高于無抑郁組和輕度抑郁組，提示HSP90αA1與抑郁存在密切聯(lián)系。孔令韜等[22]的動物實驗結(jié)果表明，慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬組織中CYCS的表達水平降低，抗抑郁藥物氟西汀和噻奈普汀可能通過抑制神經(jīng)元內(nèi)線粒體釋放CYCS，達到減少應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡，從而起到治療抑郁的作用。CDK2的作用不僅局限于調(diào)控細(xì)胞周期，而且能夠參與對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，從而影響抑郁癥狀[23]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ESR1基因多態(tài)性與女性圍絕經(jīng)期抑郁癥狀存在關(guān)聯(lián)，而其與5-羥色胺基因多態(tài)交互作用可能增加女性圍絕經(jīng)期抑郁的風(fēng)險[24-25]。

我們將184個鹽酸小檗堿治療抑郁的潛在作用靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進行GO生物學(xué)功能分析，結(jié)果顯示，這些靶點參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，以及多種蛋白、氨基酸、脂質(zhì)代謝和缺氧的調(diào)控。對184個靶點進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，這些靶點能夠?qū)?xì)胞周期、p53信號通路、FoxO信號通路、多種營養(yǎng)物質(zhì)的合成等進行調(diào)節(jié)。以上結(jié)果提示鹽酸小檗堿可通過多層次、多途徑發(fā)揮治療抑郁癥的作用。

有研究結(jié)果表明，抑郁癥的病因與應(yīng)激引起的神經(jīng)元細(xì)胞的萎縮和死亡有關(guān)[26-27]。 p53是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子， p53信號通路的激活可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，這可能是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生和發(fā)展的原因之一[28]。也有研究顯示，DNA的表觀遺傳學(xué)修飾在抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[29-30]。以上均表明，抑郁癥的發(fā)生與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期有著密切聯(lián)系。并且多種抗抑郁藥物能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡、促進神經(jīng)細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，起到治療抑郁的效果[26，31-32]。而我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿也能影響細(xì)胞周期、凋亡、增殖等多個過程，并可參與p53信號通路的調(diào)控。

近年有研究表明，大腦中氧化應(yīng)激水平的升高和能量代謝的異常在抑郁癥的發(fā)病機制中起著重要作用[33-36]。缺氧誘導(dǎo)因子1可調(diào)節(jié)糖代謝、能量代謝、血管新生、炎癥因子等相關(guān)基因的表達，以應(yīng)對組織中氧含量的降低或缺氧[37]。缺氧誘導(dǎo)因子1還可通過介導(dǎo)線粒體代謝來減輕氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗缺氧作用[38]。因此，間歇性低氧適應(yīng)和高壓氧治療被認(rèn)為是治療抑郁癥的新的補充療法[39]。而在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿能夠調(diào)節(jié)對缺氧的反應(yīng)，說明其可能會通過對缺氧的調(diào)節(jié)，發(fā)揮治療抑郁癥的作用。

FoxO在細(xì)胞生理和生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用。有研究結(jié)果表明，F(xiàn)oxO參與了嚴(yán)重抑郁障礙的發(fā)生：FoxO上游分子的改變，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子或蛋白激酶B被認(rèn)為與抑郁癥有關(guān)[40]；此外，F(xiàn)oxO可能受5-羥色胺和去甲腎上腺素受體信號及下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)節(jié)，而FoxO可調(diào)節(jié)神經(jīng)元形態(tài)、突觸發(fā)生和成年海馬神經(jīng)發(fā)生[41]；黃英杰等[42]已經(jīng)證實FoxO 1抑制劑AS1842856能夠逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的小鼠抑郁樣行為。而本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可能通過調(diào)節(jié)FoxO信號通路，發(fā)揮治療抑郁癥的作用。

綜上所述，鹽酸小檗堿可能通過p53信號通路、FoxO信號通路、調(diào)控缺氧等多種途徑發(fā)揮治療抑郁癥的作用，其中有部分靶點和作用機制已有文獻證實，在一定程度上證明了本研究的可靠性，其余作用靶點和作用機制尚需進一步探索和證實。