梁 媛 吳浩源 張馨月 梁 健

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧市 530000，電子郵箱：805347258@qq.com；2 廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南寧市 530004)

肝癌是我國(guó)消化系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均較高[1]，且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。由于腫瘤壓迫、致痛介質(zhì)(炎性因子等)分泌、癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等原因，約有70%的中晚期肝癌患者伴有疼痛表現(xiàn)[2]。因此疼痛成為困擾癌癥患者的主要癥狀之一，直接影響患者的個(gè)人生活。當(dāng)前臨床使用的癌痛治療方法是世界衛(wèi)生組織推薦的“三階梯止痛法”[3]，根據(jù)患者的疼痛程度，給予不同強(qiáng)度的阿片或非阿片類(lèi)止痛藥以提高患者的生存質(zhì)量。然而，采用該原則進(jìn)行治療會(huì)導(dǎo)致潰瘍、尿潴留，甚至耐藥、成癮等不良反應(yīng)。近年來(lái)，中醫(yī)藥逐漸成為臨床治療癌痛的輔助手段，有研究證實(shí)中醫(yī)藥與止痛藥的結(jié)合使用，可以提高止痛藥的療效并減輕副作用[4]。有學(xué)者探討了芍藥甘草湯治療肝癌晚期疼痛的效果[5]，但沒(méi)有進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析芍藥甘草湯方藥的有效活性成分和作用靶點(diǎn)，初步探討芍藥甘草湯治療肝癌癌痛的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 芍藥甘草湯藥物活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(https://tcmsp-e.com/)收集芍藥甘草湯中白芍、甘草的化學(xué)成分[6]。以口服生物利用度≥30%、藥物相似性≥0.18為閾值設(shè)置ADME屬性，獲取藥物相關(guān)活性成分。再利用該平臺(tái)獲取活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息；篩選完成后合并、去重，然后使用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)對(duì)收集到的靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范，以方便后續(xù)的研究。

1.2 肝癌癌痛相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 以“l(fā)iver cancer” “hepatocellular carcinoma”和“cancer pain”作為關(guān)鍵詞，搜索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com)中與肝癌、癌痛相關(guān)的靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵詞后分別以Score≥19.66、Score≥9.485和Score≥13.985為篩選條件，找到相對(duì)應(yīng)的肝癌、癌痛靶點(diǎn)。

1.3 芍藥甘草湯活性成分-肝癌癌痛靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用網(wǎng)絡(luò)在線(xiàn)工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，針對(duì)芍藥甘草湯活性成分的作用靶點(diǎn)與肝癌、癌痛的靶點(diǎn)繪制韋恩圖，所得的交集靶點(diǎn)即為芍藥甘草湯作用于肝癌癌痛的靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.7.1對(duì)前期收集到的關(guān)于藥物成分和交集靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“藥物活性成分-肝癌癌痛靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，選擇軟件自帶工具中的“Analyze Network”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥?/p>

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，選擇生物種類(lèi)為“Home sapiens”，相互作用值設(shè)為“highest confidence”(>0.9)，其余設(shè)置均不改變，得到PPI圖。通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件中的插件cytoHubba對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析、篩選，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體論功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(shū)通路富集分析 將芍藥甘草湯治療肝癌癌痛的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://metascape.org/gp/index.html)，設(shè)置P<0.01，進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，選排前20位的條目進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 芍藥甘草湯藥物活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn) 共獲得白芍化學(xué)成分85種、甘草化學(xué)成分280種。篩選后得到白芍活性成分13種及其作用靶點(diǎn)123個(gè)；甘草活性成分92種及其作用靶點(diǎn)1 769個(gè)。經(jīng)過(guò)合并去重，最終獲得芍藥甘草湯活性成分作用的靶點(diǎn)231個(gè)，對(duì)應(yīng)活性成分共93種，其中白芍5種，甘草85種，共有成分3種。

2.2 肝癌癌痛靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)關(guān)鍵詞“l(fā)iver cancer”“hepatocellular carcinoma”分別獲得肝癌相關(guān)靶點(diǎn)1 033個(gè)、927個(gè)，合并刪除重復(fù)值，最終獲得肝癌相關(guān)靶點(diǎn)1 339個(gè)；根據(jù)關(guān)鍵詞“cancer pain”獲得癌痛相關(guān)靶點(diǎn)1 476個(gè)。使用同樣的關(guān)鍵詞結(jié)合檢索策略，在OMIM與DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)的篩選，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選結(jié)果合并后去重，最終獲取肝癌相關(guān)靶點(diǎn)1 498個(gè)，癌痛相關(guān)靶點(diǎn)1 873個(gè)。

2.3 芍藥甘草湯活性成分-肝癌-癌痛靶點(diǎn)的可視化網(wǎng)絡(luò) 將篩選出的藥物有效成分靶點(diǎn)與肝癌、癌痛靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，獲得交集靶點(diǎn)125個(gè)，芍藥甘草湯作用于肝癌癌痛靶基因的映射率為5.1%，見(jiàn)圖1。交集靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)芍藥甘草湯中的90個(gè)化學(xué)成分，其中甘草83種，白芍4種，甘草和白芍共有成分3種，見(jiàn)表1。使用Cytoscape 3.7.1軟件對(duì)藥物活性成分和交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)216個(gè)，邊1 175條，見(jiàn)圖2。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，按度值大小排序，度值最高的藥物活性成分為槲皮素(度值為99，介度為0.188 776，緊密度為0.582 66)，其次為山柰酚(度值為34，介度為0.034 042，緊密度為0.439 67)、柚皮素(度值為24，介度為0.020 178，緊密度為0.417 48)，推測(cè)槲皮素、山柰酚和柚皮素為芍藥甘草湯治療肝癌癌痛的主要成分，見(jiàn)表2。

圖1 芍藥甘草湯活性成分-肝癌-癌痛的共有靶點(diǎn)

表1 芍藥甘草湯干預(yù)肝癌癌痛的活性成分及其對(duì)應(yīng)藥物

續(xù)表1

圖2 芍藥甘草湯活性成分-肝癌癌痛靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 芍藥甘草湯主要藥物活性成分的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的獲取 將交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)后得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。使用Cytoscape 3.7.1中的插件cytoHubba選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。使用該插件的MCC算法對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，通過(guò)Score排序，選取排前10的靶點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)顏色越深代表分值越高)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，即是原癌基因JUN、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活劑3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-4、C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C motif chemokine ligand 8,CXCL8)、C-C基序趨化因子2(C-C motif chemokine 2,CCL2)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)，見(jiàn)圖4。

圖3 芍藥甘草湯活性成分肝癌癌痛交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示，芍藥甘草湯治療肝癌癌痛相關(guān)靶點(diǎn)參與的生物進(jìn)程主要包括對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)等；涉及的主要細(xì)胞組分包括膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等；涉及的主要分子功能包括蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、以醇基為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等，見(jiàn)圖5。參與的通路主要有癌癥通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。

圖5 GO功能富集分析(僅展示前20個(gè)條目)

圖6 KEGG通路富集分析(僅展示前20位)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝癌病位在肝，屬于“積聚” “黃疸” “腹水”等范疇，多由于早期情志不暢，肝氣不舒，以致氣機(jī)瘀滯失于宣發(fā)，經(jīng)絡(luò)血脈瘀阻，日漸成積。晚期癌痛的病因病機(jī)為機(jī)體正氣不足，病勢(shì)遷延纏綿，日久則耗氣傷陰，氣陰兩虛，臟腑經(jīng)脈失養(yǎng)而痛。當(dāng)以益氣滋陰、養(yǎng)血止痛為基本治療原則。芍藥甘草湯出自張仲景的《傷寒論》，該方由白芍、甘草組成，用于治療陰液不足、機(jī)體筋脈失于濡養(yǎng)所致的攣急疼痛。方中白芍苦寒為君，甘草甘平為臣，君臣相互配伍，酸甘同用以增強(qiáng)滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)益津液之功效，調(diào)和肝脾以發(fā)揮緩急止痛之功效。當(dāng)代藥理學(xué)研究顯示，芍藥甘草湯有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[7]。其中，白芍能顯著抑制包括肝癌在內(nèi)的癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬[8]；并減少化學(xué)藥物誘導(dǎo)的急性肝損傷，降低肝組織中 IL-6和TNF-α的表達(dá)水平，發(fā)揮抗炎護(hù)肝的作用[9-10]。甘草不僅能保護(hù)肝臟、改善肝臟的炎性環(huán)境，還能影響細(xì)胞周期、誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬、抑制腫瘤增殖[11]。

本研究獲得芍藥甘草湯與疾病的交集靶點(diǎn)共125個(gè)，芍藥甘草湯作用于肝癌癌痛靶基因的映射率為5.1%，說(shuō)明芍藥甘草湯存在干預(yù)肝癌癌痛的作用靶點(diǎn)，對(duì)肝癌癌痛有一定的特異性治療作用。經(jīng)初步篩選后發(fā)現(xiàn)，芍藥甘草湯調(diào)治肝癌癌痛的主要活性成分為黃酮類(lèi)化合物，包括槲皮素、山柰酚和柚皮素等。槲皮素的抗癌作用已在幾種癌癥中[12-14]表現(xiàn)出來(lái)，包括肝癌[15]。既往研究顯示，槲皮素能顯著降低Toll樣受體4蛋白和mRNA的表達(dá)，促使髓樣分化因子88、細(xì)胞核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)、IL-6及IL-17的失活，發(fā)揮保肝的作用[16]；同時(shí)靶向蛋白酶激活受體2/瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1通路，降低TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平，從而抑制癌痛的發(fā)生[17]。山柰酚作為一種常見(jiàn)的中藥成分，不僅能抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[18]，減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)正常肝細(xì)胞[19]；還能通過(guò)直接減少AGE的形成來(lái)抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，顯著抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，提高熱痛覺(jué)和機(jī)械痛覺(jué)的閾值，對(duì)疼痛具有一定的緩解作用[20]。柚皮素有抗氧化、抗病毒的作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[21]，同時(shí)還能抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的釋放，緩解炎癥性疼痛[22]。

本研究的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，芍藥甘草湯治療肝癌癌痛的靶點(diǎn)主要包括JUN、TNF、STAT3、IL-1β、IL-6等。JUN屬于轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1，包括c-Jun、JunB、JunD，其中多以c-Jun為主。c-Jun被活性氧激活后，可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散，加速癌癥病程進(jìn)展，加重癥狀表現(xiàn)[23]。TNF參與全身炎癥反應(yīng)，有臨床研究報(bào)告疼痛不明顯的肝癌患者體內(nèi)TNF與IL-6水平較低[24]。同樣，STAT3在炎癥和慢性疼痛中也有顯著改變，研究顯示，抑制JAK2/STAT3通路后，患者體內(nèi)IL-6與IL-1β表達(dá)水平降低，疼痛表現(xiàn)也相應(yīng)減輕[25]。炎癥是肝癌微環(huán)境的重要特征之一[26]，限制炎癥因子的釋放，抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)及下調(diào)相關(guān)信號(hào)表達(dá)，癌癥相關(guān)癥候群(疼痛、惡心、睡眠障礙等)的癥狀能得到顯著改善[27]。

芍藥甘草湯治療肝癌癌痛的主要通路有AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。AGE-RAGE信號(hào)通路參與肝臟疾病(如肝損傷、炎癥反應(yīng)、肝纖維化)的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，在肝癌組織中AGE與RAGE蛋白表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤的增殖、血管新生和侵襲[28-29]。IL-17信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)有關(guān)，是診斷和治療肝癌的有效靶點(diǎn)[30]。IL-17可與TNF-α共同誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6，而IL-6不僅可促進(jìn)C反應(yīng)蛋白的生成，也對(duì)IL-17有正向反饋?zhàn)饔?，三者互相影響加重炎癥反應(yīng)；同時(shí)肝臟炎癥可導(dǎo)致肝損傷，因此，IL-17可以協(xié)同TNF-α通過(guò)提高IL-6水平誘導(dǎo)體內(nèi)C反應(yīng)蛋白和AST水平升高，進(jìn)而介導(dǎo)肝臟炎癥反應(yīng)[31]。此外，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL-17與其他疾病(如多發(fā)性硬化癥[32])的疼痛癥狀有關(guān)，但在肝癌癌痛中的作用機(jī)制還未可知。HIF-1在機(jī)體的缺氧應(yīng)答中至關(guān)重要，在腫瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮著積極的作用，可以促進(jìn)腫瘤的血管新生，維持能量代謝，促進(jìn)腫瘤增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[33]。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究表明，相對(duì)于肝癌疼痛不明顯的患者，肝癌疼痛明顯的患者血清樣本中的HIF-1及其下游因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平顯著升高，患者疼痛發(fā)生率和疼痛程度也與這兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)水平呈正相關(guān)[34]。

綜上所述，芍藥甘草湯可能通過(guò)槲皮素、山柰酚、柚皮素等活性成分作用于JUN、TNF、STAT3等相關(guān)靶點(diǎn)，影響AGE-RAGE、IL-17、HIF-1等通路，阻止肝癌細(xì)胞增殖，減少致痛介質(zhì)釋放，緩解因腫瘤生長(zhǎng)引起的牽涉痛及炎性因子相關(guān)性疼痛，從而達(dá)到治療肝癌癌痛的目的。然而，本研究存在一定局限性，沒(méi)有考慮實(shí)際用藥劑量、藥物在體內(nèi)代謝等因素的影響，今后仍需進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步闡釋芍藥甘草湯緩解肝癌癌痛的作用機(jī)制。