紀雅婷，趙 梅，陳家蘭，鄭友峰，賴鐘雄，劉生財*

（1.福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；2.西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

莧菜屬于石竹目莧科莧屬一年生短日照的C4 草本植物[1]，富含維生素和礦物質[2]，是營養(yǎng)價值極高的蔬菜之一，且莖葉茂盛，生長速度快[1]，容易適應土壤環(huán)境，對土地沒有較嚴格的要求[3]。作為世界糧農組織推薦的蔬菜，其在世界各地均有種植[1]。

MDH基因廣泛存在于動植物和微生物中，其在植物中的作用具有多樣性，在光合作用、pH 的平衡和豆科根瘤功能中發(fā)揮重要作用[4]，參與種子萌發(fā)、細胞生長、花粉發(fā)育、糖的積累、果實發(fā)育和成熟、植物抗逆性等[5]。對光合作用也有重要作用，可催化蘋果酸發(fā)生的可逆的脫氫反應，在C3 途徑葉綠體中蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）催化草酰乙酸生成的蘋果酸通過草酰乙酸/蘋果酸穿越到細胞質中，并氧化產(chǎn)生NADH，為硝酸還原反應提供還原力，且為氨基酸合成提供碳骨架，在NADP-ME 型C4 植物葉肉細胞中，作為C4 光合途徑的關鍵酶，MDH 將葉綠體中的草酰乙酸還原為蘋果酸，蘋果酸轉運到維管束鞘細胞葉綠體中，脫羧釋放CO2用于參與卡爾文循環(huán)，是參與C4 途徑中重要的限速步驟[6-7]?？梢奙DH 對植物的光合作用有著關鍵影響，而C4 植物相較于C3 植物有著更高的光合效率，所以MDH基因在C4 植物的表達以及功能有研究意義。

目前人們已經(jīng)從蘋果[8]、小麥[8]、花生[9]、香蕉[10]、木薯[11]等植物中克隆出MDH 基因，已有對其在非生物逆境脅迫應答[12]和超量表達提高對鋁毒的耐受性[13]等方面的研究，但對在C4 植物莧菜中MDH基因研究較少。因此，該研究對莧菜中的MDH基因進行克隆和生物信息學分析，為將來深入研究該基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

使用福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供的莧菜（Amaranthus tricolorL.）無菌試管苗作為研究材料。

1.2 方法

1.2.1 莧菜試管苗總RNA 提取及質量檢測。使用多糖多酚植物總RNA 快速提取試劑盒（百泰克公司）對莧菜試管苗總RNA 進行提取。用瓊脂糖凝膠電泳對RNA 完整性進行檢測，后使用超微量核酸檢測儀（Thermo 公司）測定RNA純度和濃度。

1.2.2 cDNA 合成。使用Fermentas 公司RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒合成cDNA 的第一鏈。

1.2.3 莧菜MDH基因引物設計及PCR 擴增。根據(jù)福建農林大學園藝植物生物工程研究所實驗室建立的莧菜轉錄組數(shù)據(jù)庫（SRA：SRR924089-SRR924092），從中查找MDH基因序列片段，通過NCBI 比對確定ORF 區(qū)域，然后根據(jù)序 列 設 計ORF 引 物（MDH-F：CGGCATGAGAACTC AAATGTT，MDH-R：CTCAATTGTTCTTCCTTGCGA）進行擴增。

1.2.4 目的片段的回收、克隆及測序。使用Biomiga 公司The Inventor of EZgeneTMand ViraTrapTMSystems Gel/PCR Extraction Kit 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，以pMD18-T為載體，轉化到感受態(tài)細胞DH5 中，再挑取單克隆進行搖菌培養(yǎng)，通過菌液PCR 初步驗證陽性克隆，再將菌液送交北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.2.5 莧菜MDH基因序列生物信息學分析。使用DNAMAN7.0 進行序列拼接及氨基酸序列推導，再用在線軟件對該基因進行生物信息學分析，并用MEGAX 軟件鄰解法對不同物種間MDH基因的關系進化樹進行構建。

1.2.6MDH基因表達量分析。對莧菜進行藍光處理和黑暗處理，并分別測其MDH基因FPKM 值，以及檢測其在生長不同階段MDH基因的RPKM 值，對MDH基因表達差異進行分析，利用EXCEL 軟件繪制柱狀圖和折線圖。

2 結果與分析

2.1 莧菜MDH 基因的ORF 克隆及其編碼的蛋白質理化性質分析預測

根據(jù)構建的莧菜轉錄組數(shù)據(jù)庫，篩選出莧菜MDH基因cDNA 片段，通過NCBI 對比確定ORF 區(qū)域，利用克隆技術獲得莧菜MDH基因ORF 序列，提交至GenBank（登錄號：KY353102）。

利用ProtParam 對莧菜中MDH 基因編碼的蛋白質理化性質分析。結果顯示，該蛋白質分子式為C1615H2618N438O494S12，由5177 個原子構成，包括344 個氨基酸，相對分子量為36459.91 Da，理論等電點（pI）8.65，帶正電的氨基酸有38（Arg+Lys）個，帶負電的氨基酸有34（Asp+Glu）個，總平均親水性為-0.024，屬于疏水蛋白，同時也是穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定指數(shù)為37.96）。

對MDH基因編碼蛋白進行生物信息學分析，結果顯示，MDH基因在多肽鏈的存在結合位點，屬于Ldh_1_C 超家族；該蛋白沒有明顯的信號肽，不屬于跨膜蛋白，且在細胞膜外；亞細胞定位預測表明該蛋白位于葉綠體和線粒體中。莧菜MDH基因編碼的蛋白質磷酸化位點（＞0.5）總數(shù)為33，其中包括18 個絲氨酸，12 個蘇氨酸和3 個酪氨酸。

蛋白二級結構預測分析顯示，莧菜MDH蛋白中α 螺旋占43.6%，無規(guī)則卷曲占34.88%，β 折疊占5.81%（圖1）。三級結構進行預測分析表明該蛋白由無規(guī)則卷曲結構，β折疊和α 螺旋構成（圖2）。

圖1 MDH 編碼蛋白質二級結構預測

圖2 MDH 編碼蛋白質三級結構預測

2.2 莧菜MDH 基因編碼的蛋白系統(tǒng)進化樹構建

通過對莧菜MDH基因編碼的氨基酸序列在線BLAST 的結果，選取不同同源性的物種氨基酸序列，用MEGAX 軟件中NeighborJoining 法將Bootstrap 檢驗值設置為1000，建立其編碼區(qū)氨基酸序列之間的系統(tǒng)關系樹。根據(jù)MDH 氨基酸序列之間關系樹的構建分析可知，莧菜MDH基因與藜麥聚類到一起，同源性較高，因莧菜與藜麥同屬石竹目，親緣關系較近，可知結果可信（圖3）。

圖3 MDH 編碼蛋白質系統(tǒng)進化樹

2.3 MDH 基因表達量分析

根據(jù)實驗室提供的在藍光處理與黑暗處理下莧菜轉錄組數(shù)據(jù)的MDH 基因FPKM 值、莧菜不同生長階段中MDH 基因RPKM 值以及在葉片紅綠部位的FPKM 值利用GraphPad Prism8 軟件進行繪圖，并進行MDH 基因表達量分析。由圖4 可知，在黑暗處理下基因表達量高于藍光處理，在莧菜幼苗期至壯苗期基因表達量出現(xiàn)了下降而花芽期到開花期基因表達量迅速增長，在葉片紅色部位基因表達量遠高于綠色部位，推測莧菜在黑暗條件下MDH基因表達更顯著在花芽期至開花期表達量上升且在葉片紅色部位表達更顯著。

圖4 莧菜MDH 基因相對表達量分析結果

3 討論與結論

該試驗通過克隆技術獲得了莧菜MDH 基因ORF 序列，并提交GenBank 登錄。蛋白系統(tǒng)進化樹構建等各種生物信息學分析研究，得出莧菜中MDH 基因可能編碼一種位于葉綠體和線粒體的非分泌蛋白，二級結構以α 螺旋為主，三級結構由無規(guī)則卷曲結構，β 折疊和α 螺旋構成，與藜麥有較近的進化關系，在黑暗條件下和葉片紅色部位表達更顯著且在開花期較其他生長時期更顯著。

MDH 基因廣泛存在于動植物以及微生物體內，并且參與光合作用多種生理活動，尤其是C4 途徑中的關鍵基因之一。該試驗對MDH 基因的亞細胞定位預測結果中MDH 可能編碼的非分泌蛋白位于葉綠體及線粒體中，結合其他學者在研究小麥和谷子中蘋果酸脫氫酶活性與光合的關系時，發(fā)現(xiàn)谷子的MDH 均與凈光合速率成正相關，以及其在C4 植物中廣泛存在，在草酰乙酸轉化為蘋果酸的過程中發(fā)揮作用[14]，推測MDH 基因在莧菜中與莧菜的光合作用有關且可能發(fā)揮同樣的作用。MDH 基因在生物體內的存在非常廣泛，其中莧菜中MDH 氨基酸序列與藜麥同屬石竹目，有較近的親緣關系，有研究關注其在谷子[12]中可能參與了抗逆性脅迫的響應，也有研究其超量表達在苜蓿[13]、煙草[15]等植株中對提高鋁毒耐性的作用，莧菜中MDH 基因與谷子、煙草等有一定親緣關系，其在莧菜中是否有相似功能還有待研究。根據(jù)對其基因表達量分析，在黑暗條件下及葉片紅色部位表達量更高推測其可能參與呼吸作用的作用機制，且可能更加有效地提高CO2利用率，在壯苗期表達量下降而在花芽期至開花期表達量上升，推測其可能對植物生殖生長發(fā)揮更大作用。對蘋果酸脫氫酶的研究已有很長時間，且研究較深入，已有學者對其在國內外的研究進展進行追溯[16]?？梢奙DH 基因是一個具有重要功能，有著長久研究價值和意義的基因。