陳青青，王叢巧，賴鐘雄*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材，栽培利用歷史悠久。其主要的藥用功能性成分為石斛多糖、生物堿及黃酮類化合物等[1]。近年來(lái)，鐵皮石斛的野生資源已瀕臨枯竭，但其離體組織培養(yǎng)產(chǎn)生的原球莖（PLBs）同樣含有大量的功能性成分，已知組培原球莖的多糖含量與二年生的野生石斛無(wú)異[2]，具有代替其原植株成為藥源的可能。植物組織培養(yǎng)可以通過(guò)配方、光溫等人為干擾其生長(zhǎng)與分化[3]，其中溫度是影響植物生長(zhǎng)的重要因素，晝夜溫差（Diurnal Temperature Fluctuation，DIF）更是植物體內(nèi)物質(zhì)積累的重要影響因子。該文設(shè)想對(duì)當(dāng)前有關(guān)晝夜溫差對(duì)鐵皮石斛（組培原球莖）生物量、多糖、生物堿等功能性產(chǎn)物的影響，進(jìn)行分析總結(jié)，以對(duì)當(dāng)前鐵皮石斛離體培養(yǎng)原球莖生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用鐵皮石斛原球莖材料由福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院植物生物工程研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

選取1 g 生長(zhǎng)較一致的圓錐狀、淡綠色、尚未分化的原球莖，接種在培養(yǎng)基為1/2MS+50 g/L 土豆+25 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)基pH 5.4～5.8，接種后放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)箱晝8：00—20：00、夜20：00—08：00進(jìn)行溫光處理，溫度設(shè)置25℃/13℃（T1）、25℃/25℃（T2 對(duì)照）2 個(gè)處理；光照強(qiáng)度2000～2500 lx。材料培養(yǎng)50 d，每隔5 d 隨機(jī)抽取12 瓶原球莖進(jìn)行生物量、可溶性多糖和生物堿含量測(cè)定，并觀察原球莖的形態(tài)，對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較和統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生物量的計(jì)算。每瓶接入1 g 原球莖前整瓶稱量，之后每隔5 d 整瓶稱量，測(cè)到第50 d。生物量計(jì)算方法：原球莖的生物量=取樣時(shí)整瓶質(zhì)量-接入PLBs 前培養(yǎng)瓶質(zhì)量。

1.3.2 多糖含量的測(cè)定。該次試驗(yàn)根據(jù)張萍[4]等的試驗(yàn)方法進(jìn)行改良，采用石油醚脫脂、Sevage 法除蛋白的多糖測(cè)定方法對(duì)PLBs 中的多糖含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 生物堿含量的測(cè)定。生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考林艷君[5]的方法。以樣品吸光度為縱坐標(biāo)，石斛堿濃度（通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得）為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。整理測(cè)定的數(shù)據(jù)，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.074X-0.01，R2=0.9364。

生物堿含量（%）=石斛堿濃度×50（稀釋倍數(shù)）÷400000（單位換算）×100%

1.4 試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用SPSS statistics 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析采用Duncan 法，顯著性水平P=0.05。采用WPS EXCEL 軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫差對(duì)PLBs 形態(tài)的影響

培養(yǎng)初期，2 處理鐵皮石斛原球莖顏色淺綠偏黃，10 d后顏色開(kāi)始慢慢轉(zhuǎn)為黃綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，慢慢由黃綠轉(zhuǎn)為鮮綠。在T2 對(duì)照處理中，原球莖團(tuán)塊第10 d 開(kāi)始就出現(xiàn)少量分化，原球莖頂部開(kāi)始變綠，出現(xiàn)細(xì)小凸起，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，凸起逐漸增大、數(shù)量增多，有部分鱗葉生成，25 d 后甚至有部分無(wú)根分化苗生成。第35 d 時(shí)，觀察到原球莖的周圍有白色細(xì)小絨毛生成。40 d 開(kāi)始，底部的原球莖出現(xiàn)黃化，顏色逐漸變白，最后變成黃褐色死亡。T1 溫差處理下，培養(yǎng)初期與T2 相同都生長(zhǎng)緩慢，20 d 以后T1 處理下的原球莖的增殖量始終比同期的T2 大，差異達(dá)顯著。15～20 d 和30～35 d之間分別出現(xiàn)原球莖數(shù)量明顯增加。第30 d 時(shí)觀察到原球莖邊緣有部分白色絨毛出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，絨毛增多。在50 d 的培養(yǎng)周期中，T1 相較于對(duì)照處理并未觀察到大量分化現(xiàn)象，且隨著增殖量的不斷增加，基部原球莖變白，最后褐化死亡。綜合以上，筆者認(rèn)為溫差處理可能更有利于原球莖的增殖。鐵皮石斛原球莖的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。

圖1 溫差對(duì)鐵皮石斛PLBs 生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.2 溫差對(duì)PLBs 生物量的影響

從鐵皮石斛PLBs 生物量變化情況來(lái)看，0～10 d 內(nèi)，2個(gè)溫度處理下鐵皮石斛生物量的增加無(wú)顯著變化，從20 d開(kāi)始至第45 d，T1 處理下原球莖的生物量始終都高于T2對(duì)照處理，在30～35 d 時(shí)，2 個(gè)溫度處理下的原球莖生物量都有一個(gè)顯著增高的趨勢(shì)。40 d 時(shí)，T1 處理下原球莖生物量的增加放緩，45 d 后開(kāi)始下降。而T2 處理40 d 后原球莖的生物量依據(jù)保持顯著增加趨勢(shì)。綜合以上，鐵皮石斛PLBs 在培養(yǎng)初期生物量增長(zhǎng)緩慢，T1 處理下30～40 d 是生物量顯著增加的時(shí)期，且生物量要高于T2 處理（圖2）。50 d 時(shí)T1 處理生物量的下降可能與基部原球莖的變白褐化死亡有關(guān)。

圖2 晝夜溫差對(duì)原球莖生物量的影響

2.3 溫差對(duì)PLBs 多糖含量及總量的影響

在培養(yǎng)初期，2 個(gè)處理的鐵皮石斛PLBs 多糖含量變化不大（圖3），20 d 開(kāi)始出現(xiàn)含量顯著變化的拐點(diǎn)。T1 處理下鐵皮石斛原球莖中多糖含量顯著下降，而T2 處理下多糖含量則顯著增加且于25 d 時(shí)達(dá)到最高值，之后逐漸下降。25～35 d，T1 處理的原球莖多糖含量顯著增加，且在35 d 時(shí)超過(guò)了T2 處理。雖然40 d 時(shí)有一個(gè)顯著下降現(xiàn)象，但在35～50 d 期間T1 處理下多糖含量在總趨勢(shì)上呈現(xiàn)增加。

圖3 溫差對(duì)鐵皮石斛PLBs 多糖含量的影響

結(jié)合鐵皮石斛PLBs 生物量的影響，筆者分析了鐵皮石斛的多糖總量，情況如圖4。在培養(yǎng)初期，T1 和T2 處理下多糖總量增加緩慢，第0～30 d，PLBs 種多糖的總量表現(xiàn)T1 雖與對(duì)照無(wú)明顯差異，但仍略低于對(duì)照。30 d 以后多糖總量也表現(xiàn)出與之前生物量變化趨勢(shì)相似的顯著增加的現(xiàn)象，T1 處理下多糖總量的增幅顯著，且在第35 d 時(shí)超過(guò)了T2 對(duì)照處理中的多糖總量。

圖4 溫差下鐵皮石斛PLBs 的多糖總量

多糖含量和總量30 d 后T2 處理開(kāi)始較大幅度提升；T1 溫差處理在30 d 和40 d 后，多糖的含量比T2 一直呈現(xiàn)較高增長(zhǎng)的趨勢(shì)。因此，溫差處理更有利于提高鐵皮石斛多糖的積累。

2.4 溫差對(duì)PLBs 生物堿含量的影響

在0～50 d 的培養(yǎng)期內(nèi)，鐵皮石斛PLBs 生物堿含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)（圖5）。在培養(yǎng)前期的0～15 d 內(nèi)，T1和T2 處理并無(wú)明顯區(qū)別，20 d 后T2 處理的生物堿含量開(kāi)始高于T1 處理，差異達(dá)顯著。T2 處理從培養(yǎng)0～50 d，雖然生物堿含量持續(xù)增長(zhǎng)，但前后差異不顯著?？傮w表明晝夜25℃恒溫處理有利于提高鐵皮石斛原球莖中生物堿的含量。

圖5 溫差下鐵皮石斛PLBs 的生物堿含量

3 討論

3.1 溫差有利于PLBs 生物量增殖

在一定溫差范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)募哟鬁夭钣欣谥参矬w內(nèi)干物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的積累。從鐵皮石斛PLBs 生物量變化情況來(lái)看，在培養(yǎng)初期，T1、T2 處理PLBs 都增長(zhǎng)緩慢，10 d 開(kāi)始就出現(xiàn)少量分化，頂部變綠，出現(xiàn)細(xì)小凸起。但T1 處理20 d 以后的原球莖的增殖量始終比同期的T2大，差異達(dá)顯著。T1 溫差處理30～40 d 是生物量顯著增加的時(shí)期，且高于T2 恒溫處理。嚴(yán)寧等[6]認(rèn)為鐵皮石斛在晝夜溫度30℃/15℃條件下栽培可以促進(jìn)光合作用，而30℃/20℃則可以促進(jìn)多糖積累。

有研究報(bào)道鐵皮石斛最佳的生長(zhǎng)溫度范圍在18℃～25℃，最適宜的溫差為10℃～15℃[7]，這與該研究結(jié)果一致。第30～35 d 時(shí)，2 處理都觀察到原球莖的周圍有白色細(xì)小絨毛生成，其可能有吸收功能，利于從培養(yǎng)基或空氣中吸收營(yíng)養(yǎng)。白色細(xì)小絨毛與生物量增殖同步，其中原因有待進(jìn)一步探討。在50 d 時(shí)T1 處理生物量的下降可能與基部原球莖的變白褐化死亡有關(guān)。

3.2 溫差有利于PLBs 多糖的積累

在一定溫差范圍內(nèi)，適當(dāng)加大溫差有利于植物體內(nèi)干物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的積累。T1 溫差處理下，25 d 時(shí)PLBs中多糖含量顯著降低，這可能與從25 d 開(kāi)始鐵皮石斛PLBs 因增殖量顯著增大而引起的生物量提高有關(guān)，PLBs內(nèi)淀粉等多糖降解為可溶性糖，為增殖提供能量。而30 d后T1 溫差處理下多糖含量顯著增加可能是由于PLBs 顏色開(kāi)始轉(zhuǎn)綠，增強(qiáng)了白天光合作用，而夜間溫度較低降低了呼吸作用，因此促進(jìn)了多糖的積累。T2 恒溫處理下，20 d時(shí)多糖含量顯著提高，之后不斷下降，可能與T2 處理20 d時(shí)出現(xiàn)分化情況有關(guān)，部分鱗葉的生成促進(jìn)促進(jìn)了光合作用，有利于多糖含量的提高，之后分化的加劇，原球莖主要以生長(zhǎng)為主，需要消耗大量的能量，使可溶性糖減少，且較高的夜溫也促進(jìn)了其能量的消耗。而相較于對(duì)照處理，T1 變溫下PLBs 較少出現(xiàn)分化，而以增殖為主，未分化的原球莖相較于有芽分化的原球莖呼吸作用較弱，較低夜溫也能使PLBs 中貯藏更多的能量物質(zhì)。因此，筆者認(rèn)為溫差能促進(jìn)原球莖的增殖，減少分化，并促進(jìn)多糖的積累。

多糖是石斛主要的藥用成分，很多研究表明，晝夜溫差能提升植物體多糖含量。齊國(guó)亮[8]研究認(rèn)為，溫差是影響枸杞果實(shí)多糖含量的主要?dú)庀笠蜃樱麑?shí)內(nèi)多糖的含量隨著溫差的增大而提高。李東[9]也發(fā)現(xiàn)低溫和溫差大是瑪咖多糖積累增加的主要原因。張春柳[10]研究認(rèn)為，25℃/15℃的10℃溫差相較于15℃和5℃的溫差，更有利于多糖的積累，糖基轉(zhuǎn)移酶基因DoGAUT1 和DoPGSIP6 也在10℃下呈現(xiàn)更高的表達(dá)量。嚴(yán)寧等[6]認(rèn)為，鐵皮石斛在晝夜溫度30℃/25℃的條件下栽培可以促進(jìn)光合作用，而在30℃/20℃條件下栽培可以促進(jìn)多糖積累。艾娟[11]等研究認(rèn)為，30℃處理的鐵皮石斛光合作用最大，20℃處理則有利于多糖積累。以上研究表明，鐵皮石斛多糖增殖需要晝夜溫差交替（10℃左右）。因此，生產(chǎn)上采用適宜的溫差處理鐵皮石斛PLBs，以增加多糖有效成分是可取的。

3.3 溫差對(duì)鐵皮石斛PLBs 生物堿含量的影響

不同產(chǎn)地植物中的生物堿含量受溫度的影響不同。梁盟等研究認(rèn)為武陵山區(qū)的烤煙中生物堿含量受溫度影響不大，而黔中山區(qū)的晝夜溫差則對(duì)烤煙中生物堿含量影響較大[12]。北方保護(hù)地條件栽培（1—9月平均氣溫在3℃～25℃）的鐵皮石斛生物堿含量明顯高于南方地區(qū)[7]。該研究發(fā)現(xiàn)原球莖培養(yǎng)初期，2 個(gè)溫度處理對(duì)PLBs 中生物堿含量并無(wú)明顯影響，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，晝夜25℃恒溫處理PLBs 中的生物堿含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)。馬紹鋆等[13]在霍山石斛的懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，生物堿的增長(zhǎng)趨勢(shì)符合次生代謝產(chǎn)物的積累動(dòng)態(tài)與細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)平行的相關(guān)性，這與該研究中生物堿的變化趨勢(shì)一致。該研究中，20 d 開(kāi)始T2 處理下的生物堿含量要高于T1 處理，這可能與20d 后T2 處理下的PLBs 開(kāi)始分化有關(guān)。周建輝[14]研究光照對(duì)石蒜愈傷組織及生物堿含量的影響發(fā)現(xiàn)，光照培養(yǎng)相較于暗培養(yǎng)，愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)較快，呈現(xiàn)一定的分化和不定根，生物堿含量也高于暗培養(yǎng)。這與該研究的結(jié)果類似，出現(xiàn)呈現(xiàn)分化的PLBs 生物堿含量更高，并認(rèn)為這可能與分化后植株光合作用加強(qiáng)有關(guān)。該研究中提高多糖含量需要13℃溫差，但增加生物堿含量需25℃恒溫，之間如何平衡需要進(jìn)一步加以研究處理。