董琬玥，王 璐，王赫明，劉樺美，林 松（通信作者），李瑞琪，唐松遠(yuǎn)

（1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（2 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

帕金森?。╬arkinson’s disease, PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其以肌僵直、靜止性震顫為主要癥狀[1]。目前，PD 的發(fā)病機(jī)制依然不明確，臨床上對(duì)它的治療方法大多為對(duì)癥治療。目前，炎癥發(fā)生已經(jīng)被證實(shí)與許多和年齡相關(guān)的慢性神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，其中促炎與抗炎的失衡被廣泛認(rèn)為是PD 發(fā)生的機(jī)制之一。尸檢發(fā)現(xiàn)，PD 患者黑質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)以小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)及細(xì)胞應(yīng)激為特征的慢性炎癥反應(yīng)，因此尋找抑制炎癥反應(yīng)的新藥，或許可以為延緩PD 提供新的方向。

魚藤酮是一種被廣泛使用的殺蟲劑，可以用作帕金森病動(dòng)物模型造模試劑。其良好的脂溶性以及能夠穿透血腦屏障的能力使其較容易地造成黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元損傷，同時(shí)，作為帕金森中典型病理變化之一的路易小體也可在施加魚藤酮后被觀察到[2]，因此本實(shí)驗(yàn)采用魚藤酮來建立大鼠PD 模型。

褪黑素是一種能夠調(diào)控人體晝夜節(jié)律以及性成熟的激素。它還具有能夠調(diào)節(jié)免疫功能的特性，如其可以促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞、T 細(xì)胞以及單核細(xì)胞等的激活和增值，并促進(jìn)細(xì)胞因子如IL-1、IL-12 和IFN-γ 等的釋放。其抗炎特性可以通過COX-2 的下調(diào)和NO 的抑制來介導(dǎo)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過建立帕金森大鼠模型來觀察補(bǔ)充褪黑素對(duì)PD大鼠的炎癥反應(yīng)和運(yùn)動(dòng)癥狀的效果，并探究其可能的機(jī)制。

1.資料與方法

1.1 材料和分組

選取2020 年6 月—2021 年7 月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康清潔的SPF 級(jí)雄性Wistar大鼠，共36 只，體重280 ～350 g。飼養(yǎng)過程中維持溫度、濕度正常。大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分三組：對(duì)照組、PD造模組、PD+褪黑素組，每組12 只。

1.2 制備動(dòng)物模型及行為學(xué)評(píng)分

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，然后利用頸背部皮下注射法注射魚藤酮進(jìn)行造模。PD 造模組和PD+褪黑素組注射魚藤酮，按照2 mg/kg/d的劑量進(jìn)行。對(duì)照組采用等量0.9%氯化鈉溶液注射，其余操作一致，持續(xù)36 d。造模結(jié)束后參考陳忻[4]等方法對(duì)36 只大鼠進(jìn)行行為活動(dòng)的觀察及行為學(xué)評(píng)分來評(píng)估其造模程度，2 ～8 分視為符合造模標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 藥物干預(yù)

將PD+褪黑素組造模成功的大鼠腹腔注射褪黑素5 mg/（kg·d）、持續(xù)2 周，PD 造模組以及對(duì)照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1 曠場(chǎng)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)全程保持安靜，將大鼠預(yù)先置于曠場(chǎng)中使其自由探索10 min。正式實(shí)驗(yàn)開始后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)自動(dòng)錄制大鼠在曠場(chǎng)5 min 內(nèi)的活動(dòng)以得到運(yùn)動(dòng)總路程和平均運(yùn)動(dòng)速度。

1.4.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠采用轉(zhuǎn)棒式疲勞儀進(jìn)行預(yù)訓(xùn)練。預(yù)訓(xùn)練時(shí)將大鼠置于轉(zhuǎn)棒上，逐漸加速至40 r/min,訓(xùn)練時(shí)間為2 d、15 min/d。2 d 后將轉(zhuǎn)棒儀設(shè)置為40 r/min 進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，每只大鼠測(cè)試3 次并取均值，記錄大鼠從轉(zhuǎn)棒開始旋轉(zhuǎn)到離開轉(zhuǎn)棒的時(shí)長(zhǎng)作為在棒時(shí)間。

1.5 樣品采集

將完全麻醉的大鼠快速斷頭、取腦；之后迅速用事先冰存的0.9%氯化鈉溶液將腦洗凈；根據(jù)大鼠腦立體定位圖在冰盒上小心分離黑質(zhì)和紋狀體，稱重后低溫保存。

1.6 ELISA 法檢測(cè)指標(biāo)

將樣品組織和冷藏的PBS 溶液加入玻璃勻漿器，并將勻漿器置于碎冰中將腦組織充分研磨，之后將勻漿液放入離心機(jī)中以3 000 轉(zhuǎn)/min 離心20 min；離心結(jié)束，將所得上清液吸取儲(chǔ)存于低溫冰箱。最后按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定NF-κB、TH、IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 各組行為學(xué)評(píng)分

注射魚藤酮36 d 造模后，對(duì)照組各項(xiàng)行為反應(yīng)正常，毛色干凈無發(fā)黃；PD 造模組和PD+褪黑素組出現(xiàn)靜止震顫等帕金森樣癥狀；對(duì)PD 模型組和PD+褪黑素組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，結(jié)果為2 ～8 分，表明全部造模成功，見表1。

表1 各組造模后的行為學(xué)評(píng)分比較（只）

2.2 各組轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較

在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，PD 造模組大鼠運(yùn)動(dòng)總路程減少，運(yùn)動(dòng)平均速度減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相較于PD 造模組大鼠，PD+褪黑素組大鼠運(yùn)動(dòng)總路程增加，平均速度有所提高（P＜0.05）；在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比對(duì)照組，PD 造模組大鼠在棒時(shí)間有所減少（P＜0.05）；與PD 造模組大鼠相比，PD+褪黑素組大鼠在棒時(shí)間有所增加（P＜0.05），見表2。

表2 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)比較（± s）

表2 各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)比較（± s）

注：#與對(duì)照組相比：P ＜0.05；*與PD 造模組相比：P ＜0.05。

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總路程/m平均運(yùn)動(dòng)速度/（mm·s-1）在棒時(shí)間/s對(duì)照組1215.50±3.2651.65±10.875.60±1.11 PD 造模組1210.30±3.50# 34.35±11.68#3.64±0.63#PD+褪黑素組1214.00±2.02* 46.65±6.74*5.03±1.15*F 6.156.158.4 P＜0.01＜0.01＜0.01曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)組別只數(shù)

2.3 褪黑素處理對(duì)黑質(zhì)TH 和NF-κB 水平的影響ELISA 檢測(cè)TH 和NF-κB，結(jié)果顯示：PD 造模組大鼠黑質(zhì)TH 水平相較對(duì)照組表達(dá)水平低（P＜0.05），PD+褪黑素組大鼠黑質(zhì)TH 表達(dá)水平相較PD 造模組高（P＜0.05）；PD 模型組大鼠黑質(zhì)NF-κB 表達(dá)水平相較對(duì)照組高（P＜0.05）。PD+褪黑素組大鼠黑質(zhì)NF-κB 水平相較PD 造模組低（P＜0.05），見表3。

表3 各組間TH 和NF-κB 水平比較（± s）

表3 各組間TH 和NF-κB 水平比較（± s）

注：#與對(duì)照組相比：P ＜0.05；*與PD 造模組比較，P ＜0.05。

組別只數(shù)THNF-κB對(duì)照組12165.08±10.86196.57±11.09 PD 造模組12142.91±9.58#215.28±12.50#PD+褪黑素組12153.99±8.74*198.81±11.51*F 10.215.99 P＜0.01＜0.01

2.4 褪黑激素處理對(duì)紋狀體炎癥因子的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，PD 造模組大鼠紋狀體內(nèi)炎癥因子IL-1β，IL-6 以及TNF-α 相較對(duì)照組有所升高，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PD+褪黑素組大鼠紋狀體炎癥相較造模組獲得一定程度緩解，TNF-α 和IL-1β、IL-6，水平相較PD 造模組均降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組間TNF-α 和IL-1β 和IL-6 水平比較（± s）

表4 各組間TNF-α 和IL-1β 和IL-6 水平比較（± s）

注：#與對(duì)照組相比：P ＜0.05；*與PD 造模組比較，P ＜0.05。

組別只數(shù)TNF-αIL-1βIL-6對(duì)照組1264.55±9.567.31±0.7440.18±5.56 PD 造模組1279.32±8.51#11.27±1.40# 50.22±6.50#PD+褪黑素組1268.41±11.66*9.80±1.31* 43.50±6.07*F 4.7522.925.68 P 0.02＜0.010.01

3.討論

PD 主要表現(xiàn)為錐體外系功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)PD 患者黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元幾乎完全丟失，繼而使其投射至紋狀體的神經(jīng)纖維發(fā)生退行性變性。最終導(dǎo)致膽堿能通路相較多巴胺能通路的優(yōu)勢(shì)地位，兩者平衡失衡從而引起震顫麻痹癥狀。PD 終晚期易造成癡呆，對(duì)患者生活狀況產(chǎn)生極大影響。研究表明，多種機(jī)制參與了PD 的病理機(jī)制，而炎癥在PD 的發(fā)病和進(jìn)展中得到廣泛認(rèn)可。

NF-κB 是一種可調(diào)控基因表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子[5],它通過激活反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄來激活和募集各種免疫細(xì)胞以及促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放。NF-κB 還與眾多疾病有比較密切的關(guān)系。許多研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 的激活與PD，腦出血以及阿爾茨海默病的發(fā)病有關(guān)。有研究表明PD 患者多巴胺能神經(jīng)元NF-κB 免疫反應(yīng)陽性率高于正常人，達(dá)70倍以上。這提示PD 與NF-κB 激活存在較高關(guān)聯(lián)。

酪氨酸羥化酶（TH）是一種限速酶，它在合成兒茶酚胺遞質(zhì)如多巴胺中發(fā)揮重要催化作用[6]，因此TH 活性的紊亂會(huì)在一定程度上影響PD 的發(fā)生發(fā)展。

褪黑素是一種松果體激素，它參與到PD 患者睡眠-覺醒周期的調(diào)節(jié)中[7]。研究證明PD DA 能神經(jīng)元的丟失和褪黑素降低之間存在著密切的關(guān)系。陽桂春等[8]發(fā)現(xiàn)在褪黑素的干預(yù)下，黑質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞的激活被顯著抑制。顧超等[9]發(fā)現(xiàn)褪黑素可以抑制神經(jīng)炎性損傷所誘導(dǎo)的DA 能神經(jīng)元的丟失從而緩解PD。馬一聞等[10]的研究表明褪黑素可抑制JAK-STATs 信號(hào)通路，從而降低促炎因子的表達(dá)，進(jìn)一步加強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)。本文行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)造模后的大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力大幅度下降，而經(jīng)褪黑素干預(yù)的大鼠在運(yùn)動(dòng)功能方面普遍優(yōu)于PD 造模組。且褪黑素可以抑制NF-κB 信號(hào)通路，減少促炎因子表達(dá)。褪黑素可有效減少由于TH 水平降低導(dǎo)致的多巴胺神經(jīng)元的損傷。

綜上，褪黑素干預(yù)可以有效改善PD 模型大鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力，且明顯抑制NF-κB 信號(hào)通路激活，減少促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。因此，褪黑素可能在抑制神經(jīng)炎癥方面為臨床治療PD 提供新思路和方向。