程 楠，王 靚，2，施 慧，丁 芮，洪星輝，方海雁，王恩宇，黃金玲2，

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.復(fù)方中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，安徽 合肥 230012；4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230001)

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均高居惡性腫瘤前列[1]。增殖與侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，是臨床上絕大多數(shù)腫瘤包括胃癌患者治療失敗、復(fù)發(fā)和死亡的首要原因[2]。因此，防治惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是改善胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。加味小陷胸湯系《傷寒論》中“小陷胸湯合四君子湯”化裁而成，具有清熱解毒、化痰破瘀、補(bǔ)氣運(yùn)脾之功。課題組前期進(jìn)行了小鼠肉瘤S180細(xì)胞株在體移植瘤模型及人胃癌SGC-7901細(xì)胞株體外侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明該方具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用[3-5]。本研究以裸鼠為研究對象，通過人胃癌SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型，探討加味小陷胸湯抗胃癌的生長增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的效應(yīng)和機(jī)制，以期為其臨床合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級雄性BALB/c-nu裸小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量為18～22 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0001]。采用無菌顆粒飼料；凈化水自由飲水；光照：8:00—20:00；溫度：22 ℃；通風(fēng)：每小時(shí)30～100次；濕度：40%～70%；噪音：小于60 dB。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審核通過，批號 AHUCM-mouse-2020035。

1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞系，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.3 藥物 加味小陷胸湯由黃連、半夏、瓜蔞、白花蛇舌草、薏苡仁、茯苓、壁虎等組成，飲片均購自安徽濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科采取水提醇沉工藝(10倍量水，提取3次，每次提取45 min)制成干浸膏(每克含3.58 g生藥)；卡培他濱片(批號 15081356)由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.4 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液(批號 8119064)：美國Gibco公司；胎牛血清(批號 20160930)：杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3β)、原癌基因蛋白(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體、β-actin抗體(批號 ATUMR2101、ATUMR2101、K0602G、K0207G、ab8226)：美國Abcam公司；IgG/HRP標(biāo)記物：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.5 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號Forma 370)：美國Thermo公司；熒光定量RT-qPCR儀(型號7900)：美國ABI公司；全電動(dòng)型高級倒置熒光顯微鏡(型號TH4-200)：日本Olympus公司；低溫離心機(jī)(型號3K15)：美國Sigma公司；電泳儀(型號FCM)：美國Protein Simple公司；ATOM全自動(dòng)酶聯(lián)免疫工作站：意大利MAROCHE公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制 將人胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)腋部皮下注射0.1 mL；待裸鼠接種處皮下移植瘤包塊達(dá)到直徑10 mm左右時(shí)，處死裸鼠，完整剝離瘤組織，將瘤組織分割成1.0 mm3左右小塊，用套管針接種于正常裸鼠右側(cè)腋部皮下進(jìn)行傳代，將傳至第四代模型裸鼠瘤組織1.0 mm3左右小塊，用套管針接種于每只裸鼠右前肢腋下，10 d后腋下可觸及明顯腫塊，隆起于皮膚表面者則視為裸鼠皮下人胃癌移植瘤模型復(fù)制成功。

2.2 分組及處理 將移植瘤模型裸鼠隨機(jī)分為5組：模型組，加味小陷胸湯低劑量(20.67 g/kg，相當(dāng)于成人臨床等效劑量的1倍)、中劑量(41.34 g/kg)、高劑量(82.68 g/kg)組，卡培他濱組(0.40 g/kg)，每組10只。灌胃給藥，灌胃容積20 mL/kg，模型組灌胃等容積蒸餾水，于模型復(fù)制第10天開始，每天1次，連續(xù)給藥4周；卡培他濱組給藥5 d、停藥2 d為1個(gè)療程，連續(xù)給藥4個(gè)療程。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 裸鼠一般情況觀察 動(dòng)態(tài)觀察各組裸鼠生長狀態(tài)、體質(zhì)量變化。

2.3.2 觀察不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)裸鼠移植瘤體積 于模型復(fù)制第10天各組按劑量給藥，給藥后每7 d用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑及垂直短徑，按公式計(jì)算移植瘤體積，體積=(長徑×短徑2)/2。

2.3.3 裸鼠移植瘤生長抑制率 于末次藥后30 min，頸椎脫臼法處死裸鼠，完整剝離瘤體，稱瘤體質(zhì)量，計(jì)算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=(模型組腫瘤質(zhì)量-藥物組腫瘤質(zhì)量)/模型組腫瘤質(zhì)量×100%。

2.3.4 Western blot法檢測腫瘤組織β-catenin、GSK-3β、C-Myc和VEGF蛋白表達(dá)水平 取腫瘤組織50 mg，勻漿后細(xì)胞裂解，提取組織蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育過夜，二抗室溫孵育，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Gelpro32蛋白印跡分析軟件檢測蛋白表達(dá)情況。

2.3.5 RT-PCR法檢測腫瘤組織β-catenin、GSK-3β mRNA表達(dá)水平 β-catenin上游引物：5′-GCACGTCCCCTTGGTTAGAA-3′；下游引物：5′-CAGGCAAACAGGTGCTCAAC-3′。GSK3β上游引物：5′-GGACTAAGGTCTTCCGACCC-3′；下游引物：5′-TAGCATCTGACGCTGCTGTG-3′。β-actin上游引物：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；下游引物：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。熒光定量PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

2.3.6 ELISA法檢測移植瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9水平 提取移植瘤組織勻漿，按照試劑盒說明書，在450 nm波長下測定吸光度，檢測MMP-2、MMP-9含量。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 接種瘤體10 d后，裸鼠腋下可觸及明顯腫塊，運(yùn)動(dòng)敏捷，反應(yīng)靈活，隨著瘤體逐漸增大，模型組裸鼠出現(xiàn)蜷縮不動(dòng)、反應(yīng)遲緩、皮色枯竭等表現(xiàn)，37 d死亡1只。藥物干預(yù)過程中，卡培他濱組干預(yù)4個(gè)療程，裸鼠精神萎靡，皮色枯竭，30 d和33 d分別死亡1只；加味小陷胸湯各劑量組給藥4周裸鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，但未見死亡。加味小陷胸湯各劑量組裸鼠接種移植瘤第10、17、24、31、38天各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較，裸鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；卡培他濱組自第17天起體質(zhì)量呈遞減趨勢，第31、38天與模型組及加味小陷胸湯各劑量組比較，裸鼠體質(zhì)量顯著減少(P<0.05)。結(jié)果說明加味小陷胸湯對SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠的生存和體質(zhì)量無明顯影響。見表1。

表1 加味小陷胸湯對移植瘤模型裸鼠體質(zhì)量的影響

3.2 加味小陷胸湯對人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤增殖的影響

3.2.1 加味小陷胸湯對裸鼠移植瘤體積的影響 移植瘤接種后第10天，各組裸鼠右側(cè)腋下均可觸及明顯包塊，包塊體積隨時(shí)間呈遞增趨勢，且第17天至第38天卡培他濱組和加味小陷胸湯各劑量組裸鼠腋下包塊體積均小于同時(shí)間點(diǎn)模型組。第24、31、38天，與模型組比較，卡培他濱組和加味小陷胸湯各劑量組包塊體積顯著減少(P<0.05)；而與卡培他濱組比較，加味小陷胸湯各劑量組包塊體積較大，第38天加味小陷胸湯各劑量組與卡培他濱組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說明加味小陷胸湯和卡培他濱可有效抑制SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠腫瘤的生長。見表2。

表2 加味小陷胸湯對人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤體積的影響

3.2.2 加味小陷胸湯對裸鼠移植瘤質(zhì)量的影響 與模型組比較，加味小陷胸湯各劑量組、卡培他濱組可顯著降低移植瘤質(zhì)量(P<0.05)；與卡培他濱組比較，加味小陷胸湯低、中劑量組移植瘤質(zhì)量顯著增加(P<0.05)。隨著加味小陷胸湯劑量的增加，對裸鼠移植瘤的抑制率增加；高劑量組抑制率與卡培他濱組相似。結(jié)果說明加味小陷胸湯和卡培他濱可顯著抑制SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠腫瘤的生長。見表3。

表3 加味小陷胸湯對人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤質(zhì)量的影響

3.3 加味小陷胸湯對裸鼠移植瘤組織β-catenin、GSK-3β、C-Myc和VEGF蛋白表達(dá)水平的影響 連續(xù)用藥4周后，加味小陷胸湯各劑量組裸鼠移植瘤組織中β-catenin、C-Myc和VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯降低，GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯升高，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明加味小陷胸湯可以顯著調(diào)節(jié)移植瘤組織Wnt/β-catenin信號通路β-catenin、C-Myc和GSK-3β及下游VEGF蛋白的表達(dá)水平。見圖1。

圖1 各組裸鼠移植瘤組織中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和VEGF蛋白表達(dá)水平比較

3.4 加味小陷胸湯對裸鼠移植瘤組織β-catenin、GSK-3β mRNA表達(dá)水平的影響 連續(xù)干預(yù)4周后，加味小陷胸湯各劑量組移植瘤組織中β-catenin mRNA表達(dá)水平明顯下降，GSK-3β mRNA表達(dá)水平則明顯升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說明加味小陷胸湯能夠顯著調(diào)節(jié)移植瘤組織Wnt/β-catenin信號通路GSK-3β和β-catenin mRNA表達(dá)水平。見表4。

表4 各組裸鼠移植瘤組織中GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較

3.5 加味小陷胸湯對裸鼠移植瘤組織中MMP-2、MMP-9水平的影響 連續(xù)用藥4周后，加味小陷胸湯各劑量組瘤組織中MMP-2、MMP-9水平明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說明加味小陷胸湯能夠顯著抑制移植瘤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)。見表5。

表5 各組裸鼠腫瘤組織中MMP-2、MMP-9水平比較

4 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，局部復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌的主要死亡原因。研究[6]表明，Wnt/β-catenin信號通路可能參與調(diào)節(jié)胃癌的病理進(jìn)程，干預(yù)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，是胃癌的潛在治療靶點(diǎn)。Wnt/β-catenin是經(jīng)典Wnt信號通路[7-9]，β-catenin是該通路較為關(guān)鍵和核心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，未被激活時(shí)，胞質(zhì)中β-catenin被軸抑制蛋白(Axis inhibition protein,AXIN)、結(jié)腸腺瘤性息肉蛋白(adenomatous polyosis coli,APC)、GSK-3β等蛋白組成的降解復(fù)合體磷酸化，進(jìn)而被泛素化并降解[10-12]；當(dāng)通路激活時(shí)，抑制APC/AXIN/GSK-3β降解復(fù)合體的穩(wěn)定性與活性，抑制β-catenin蛋白降解，轉(zhuǎn)移入核，結(jié)合T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子，激活c-Myc、AXIN2、Cyclin D1等靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)等功能的調(diào)節(jié)[13-16]。胃癌病理過程中，Wnt/β-catenin信號通路激活可刺激MMP2、MMP9、VEGF等表達(dá)，調(diào)節(jié)胃癌血管新生及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等環(huán)節(jié)，促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[17-18]。

中醫(yī)認(rèn)為胃癌病在胃脘[19]，因癌毒在體內(nèi)蘊(yùn)蓄積聚而發(fā)，癌毒痰瘀膠結(jié)盤踞，是胃癌的關(guān)鍵病理所在。癌毒肆虐，耗傷氣血，傷人正氣，邪實(shí)導(dǎo)致正虛而虛實(shí)夾雜，因此胃癌治療當(dāng)以解毒祛邪為要，兼顧扶正補(bǔ)虛，清熱解毒、化痰祛瘀是基本治療大法。加味小陷胸湯是由小陷胸湯合四君子湯化裁而成，該方可改善中晚期胃癌患者生活質(zhì)量，有效抑制胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果表明，加味小陷胸湯可有效抑制SGC-7901胃癌移植瘤模型裸鼠腫瘤的生長，中、高劑量組較低劑量組更為有效，高劑量組藥效與卡培他濱組更為接近；可顯著調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路及下游信號分子的蛋白及基因表達(dá)水平，且對裸鼠無明顯的毒性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)加味小陷胸湯調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的作用，并初步揭示該作用與干預(yù)胃癌生長及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。下一步課題組將通過體外細(xì)胞干預(yù)，進(jìn)一步明確其調(diào)控靶點(diǎn)，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。