周家梅，胡光民，程連芝，馬俊龍，王帆競，周 鵬，江愛娟

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012)

神經(jīng)病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥之一，以外周體感異常直接引起的痛覺過敏、自發(fā)痛和誘發(fā)痛為主要癥狀[1]。以往研究認(rèn)為，神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)功能的變化引起的。然而，臨床上常用的以神經(jīng)細(xì)胞為靶點(diǎn)的鎮(zhèn)痛藥物療效并不理想，這表明某些非神經(jīng)細(xì)胞因素在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。因此，需要將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到神經(jīng)細(xì)胞以外的其他細(xì)胞的潛在作用上。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，可以監(jiān)測和穩(wěn)定周圍環(huán)境，有利于神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)及修復(fù)[4]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理過程中發(fā)揮重要作用。

益氣活血通絡(luò)方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，其功效是益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)，對糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的四肢麻木、感覺遲鈍和疼痛有較好療效[5-6]，但其作用機(jī)制尚未明了。本研究擬通過高脂喂養(yǎng)4周聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(35 mg/kg)制備DNP大鼠模型[7]，觀察益氣活血通絡(luò)方干預(yù)后，大鼠的機(jī)械痛閾和熱縮足反應(yīng)時(shí)間、大鼠脊髓組織中補(bǔ)體受體-3的單克隆抗體(monoclonal antibody of complement receptor type 3，OX42)和P2X7(purinergic 2X7)的表達(dá)情況，探討益氣活血通絡(luò)方防治DNP的作用及其分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 80只SD大鼠，健康清潔級，雄性，6周齡，體質(zhì)量180～210 g，購自南京青龍山動物實(shí)驗(yàn)中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2014-0001]。所有大鼠自由飲水，室內(nèi)濕度25%～30%，室內(nèi)溫度20～25 ℃。

1.2 藥物及試劑 益氣活血通絡(luò)方是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由黃芪、當(dāng)歸、雞血藤、生地黃、葛根、延胡索、威靈仙7味中藥材組成，批號 20190228；甲鈷胺片(1712070f)：衛(wèi)材中國藥業(yè)公司；STZ(批號 ez3414B220)：BioFroxx；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趨化因子配體3(CC-chemokine ligand 3，CCL3)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號分別為202101、202101、202101)：江蘇酶免實(shí)業(yè)公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號 PICP123223)：ThermoFisher；ECL顯影試劑(批號 ATSAP2501)：Abbkine；OX42(批號 ab1211)、P2X7(批號 ab109054)：Abcam。

1.3 儀器 血糖儀(5D-2型)：北京怡成；纖維絲測痛儀(Von Frey)：North Coast；智能熱板儀(RB200型)：成都泰盟；凝膠成像分析系統(tǒng)(FCM)：protein simple；水浴鍋(H11210)：Leica；電泳儀(mini protean 3 cell)：BIO-RAD；熒光顯微鏡(ECLIPSE Ni)：NIKON；冰凍切片機(jī)(CM1850)：徠克公司；酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(ATOM)：Maroche。

2 方法

2.1 DNP大鼠模型的制備、分組及給藥 80只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選擇12只大鼠作為空白組，以普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠飼喂高脂飼料4周，單次腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，72 h后測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG>11.1 mmol/L認(rèn)定為2型糖尿病大鼠。2周后，檢測2型糖尿病大鼠機(jī)械痛閾和熱縮足反應(yīng)時(shí)間。如果兩者都降低到基本值的85%以下，則確定為DNP模型復(fù)制成功大鼠。將DNP大鼠隨機(jī)分為5組：模型組，益氣活血通絡(luò)方高劑量(9 g/kg，相當(dāng)于成人臨床用量的18倍)、中劑量(4.5 g/kg)、低劑量(2.25 g/kg)組和陽性對照組，每組12只。益氣活血通絡(luò)方高、中、低劑量組分別給予不同劑量益氣活血通絡(luò)方灌胃，陽性對照組大鼠予以甲鈷胺(0.175 mg/kg)灌胃，模型組大鼠用等量的生理鹽水灌胃。DNP大鼠模型復(fù)制成功時(shí)(即給藥前)計(jì)為0周，治療組大鼠連續(xù)灌胃給藥8周。于治療第0周每組隨機(jī)取6只大鼠，禁食不禁水12 h，尾部無菌操作后取靜脈血，血糖儀檢測FBG值后，3只大鼠的L4—L6節(jié)段脊髓組織用于Western blot檢測大鼠脊髓中OX42和P2X7蛋白表達(dá)水平，3只大鼠的L4—L6節(jié)段脊髓組織用于免疫熒光檢測大鼠脊髓中OX42和P2X7蛋白表達(dá)水平。每組剩下的6只大鼠于第0、2、4、6、8周測機(jī)械痛閾值和熱縮足反應(yīng)時(shí)間。于治療第8周每組取剩下的6只大鼠，禁食不禁水12 h，尾部無菌操作后取靜脈血，血糖儀檢測FBG值后，3只用于Western blot檢測，3只用于免疫熒光檢測。

2.2 大鼠FBG值測定 大鼠于治療第0周和第8周，禁食不禁水12 h，尾部無菌操作后取靜脈血，血糖儀檢測FBG值。

2.3 大鼠機(jī)械痛閾測定 于第0、2、4、6、8周，將空白組、模型組和各給藥組大鼠置于篩狀金屬板上，用有機(jī)玻璃罩分隔，待大鼠適應(yīng)后，用纖維絲垂直刺激大鼠右后掌，大鼠出現(xiàn)陽性反應(yīng)(抬腿躲避或者舔足)。每次間隔15 s，測5次，記錄每次發(fā)生陽性反應(yīng)的最小克數(shù)，取其平均值即為該大鼠的機(jī)械痛閾值。

2.4 大鼠熱縮足反應(yīng)時(shí)間測定 于第0、2、4、6、8周，將空白組、模型組和各給藥組大鼠放入預(yù)熱為52 ℃的智能熱板儀中，在放入時(shí)同步進(jìn)行計(jì)時(shí)，大鼠舔后足時(shí)結(jié)束計(jì)時(shí)，間隔15 min檢測1次，測3次取其平均值為大鼠的熱縮足反應(yīng)時(shí)間。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平 給藥第8周末，每組取3只大鼠腹主動脈血，離心，取上清，采用ELISA法，使用試劑盒測定血清TNF-α、IL-1β、CCL3含量。嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行操作。

2.6 Western blot法檢測大鼠脊髓中OX42、P2X7蛋白表達(dá)水平 給藥第8周末，取大鼠的L4—L6脊髓組織，提取總蛋白，蛋白定量檢測(BCA法)后，經(jīng)SDS-PAGE垂直凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉NC膜2 h，結(jié)束后分別加入OX42、P2X7和β-actin內(nèi)參的特異性一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入對應(yīng)二抗常溫孵育2 h后，按ECL顯影試劑說明，在凝膠成像系統(tǒng)中自動顯影。

2.7 免疫熒光檢測大鼠脊髓中OX42、P2X7的表達(dá)水平 給藥第8周末，各組大鼠于麻醉、4%多聚甲醛心臟灌注后，取L4—L6節(jié)段脊髓組織，獲得冰凍切片。切片經(jīng)血清封閉30 min后，滴加OX42或P2X7于4 ℃冰箱中孵育過夜，次日避光滴加熒光二抗，于37 ℃孵育1 h，封片后熒光顯微鏡下觀察各組大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中OX42和P2X7的顯色情況，使用Image J計(jì)算OX42和P2X7各自的熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠FBG的影響 給藥前(第0周)，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠FBG顯著上升(P<0.05)，但模型組和各治療組大鼠FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)8周后，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠FBG顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡(luò)方各劑量組和陽性對照組大鼠FBG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡(luò)方高劑量組；D.益氣活血通絡(luò)方中劑量組；E.益氣活血通絡(luò)方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05

3.2 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠機(jī)械痛閾的影響 給藥前(第0周)，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠機(jī)械痛閾均顯著下降(P<0.05)，模型組和各治療組大鼠機(jī)械痛閾差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第2、4、6、8周后，與空白組比較，模型組機(jī)械痛閾顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡(luò)方各劑量組和陽性對照組機(jī)械痛閾均顯著上升(P<0.05)。見圖2。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡(luò)方高劑量組；D.益氣活血通絡(luò)方中劑量組；E.益氣活血通絡(luò)方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.3 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠熱縮足反應(yīng)時(shí)間的影響 給藥前(第0周)，與空白組比較，模型組和各治療組大鼠的熱縮足反應(yīng)時(shí)間均顯著縮短(P<0.05)，但模型組和各治療組大鼠熱縮足反應(yīng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第2、4、6、8周后，與空白組比較，模型組大鼠熱縮足反應(yīng)時(shí)間顯著縮短(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡(luò)方各劑量組和陽性對照組熱縮足反應(yīng)時(shí)間均顯著延長(P<0.05)。見圖3。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡(luò)方高劑量組；D.益氣活血通絡(luò)方中劑量組；E.益氣活血通絡(luò)方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.4 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平的影響 治療8周后，與空白組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡(luò)方高、中劑量組和陽性對照組大鼠血清TNF-α水平均顯著下降(P<0.05)，低劑量組大鼠血清TNF-α水平有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；益氣活血通絡(luò)方各劑量組和陽性對照組大鼠血清IL-1β、CCL3水平均顯著下降(P<0.05)。見圖4。

圖4 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠血清TNF-α、IL-1β、CCL3水平的影響

3.5 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠脊髓組織OX42和P2X7表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示，第8周末，與空白組比較，模型組大鼠脊髓組織中OX42、P2X7蛋白表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡(luò)方中劑量組和陽性對照組大鼠脊髓組織中OX42蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，益氣活血通絡(luò)方各劑量組和陽性對照組大鼠脊髓組織中P2X7蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)。見圖5。

圖5 益氣活血通絡(luò)方對DNP大鼠脊髓組織OX42、P2X7蛋白表達(dá)水平的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠脊髓組織中OX42(綠色)和P2X7(紅色)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與模型組比較，益氣活血通絡(luò)方各劑量組和陽性對照組大鼠脊髓組織中OX42、P2X7熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)。見圖6、圖7。

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡(luò)方高劑量組；D.益氣活血通絡(luò)方中劑量組；E.益氣活血通絡(luò)方低劑量組；F.陽性對照組

注：A.空白組；B.模型組；C.益氣活血通絡(luò)方高劑量組；D.益氣活血通絡(luò)方中劑量組；E.益氣活血通絡(luò)方低劑量組；F.陽性對照組；與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

有研究[8]報(bào)道，2019年全球有4.63億糖尿病患者(20～79歲)，中國糖尿病患者總數(shù)為1.16億，居首位。而20%～30%糖尿病患者最終伴發(fā)DNP，DNP會導(dǎo)致不同程度的身體殘疾，且長期的慢性疼痛會導(dǎo)致失眠、抑郁、焦慮等癥狀[1]，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，這是疼痛研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)課題。

目前，DNP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床暫無特效藥物，一般只能在控制血糖的同時(shí)給予止痛、營養(yǎng)神經(jīng)和改善微循環(huán)等對癥支持治療，這能起到一定的治療和緩解作用，但在改善患者全身癥狀方面療效不理想。常用的藥物為抗癲癇藥(普瑞巴林、加巴噴丁等)和抗抑郁藥(度洛西汀、阿米替林等)，雖然能有效緩解癥狀，但帶來的不良反應(yīng)常常是患者所無法承受的[9]。中藥的多靶點(diǎn)性與DNP本身的復(fù)雜性決定了中藥復(fù)方在治療此病的獨(dú)特優(yōu)勢。

OX42作為小膠質(zhì)細(xì)胞活化的表面標(biāo)志物，是小膠質(zhì)細(xì)胞常用且具有高度特異的表面標(biāo)志物[10]。當(dāng)周圍神經(jīng)受損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞會發(fā)生形態(tài)改變伴隨OX42的表達(dá)增加，與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)[11]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞上的嘌呤能信號在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。在周圍神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，形態(tài)和功能發(fā)生變化，細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)嘌呤P2X7受體基因表達(dá)上調(diào)[12-13]。P2X7受體是P2嘌呤能受體的一個(gè)亞型，感覺神經(jīng)末梢釋放的受體激動劑(包括ATP及其衍生物)可與P2X7受體結(jié)合，使感受器活化，介導(dǎo)疼痛的感覺和傳導(dǎo)[14-15]，在炎癥性疼痛和神經(jīng)性疼痛的發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用[16-17]。Wu等[18]認(rèn)為，P2X7在神經(jīng)病理性疼痛中充當(dāng)內(nèi)源性激動劑的作用。P2X7受體特異性阻滯劑(如a-438079和a-740003)可降低DNP大鼠的疼痛反應(yīng)[19-20]。小鼠的P2X7受體基因被敲除后，小鼠對疼痛的超敏反應(yīng)在神經(jīng)損傷后消失[21]。此外，P2X7受體的高表達(dá)也能促進(jìn)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞CCL3的釋放[22]。在對STZ誘導(dǎo)的DNP模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角組織中CCL3和P2X7受體的高表達(dá)參與痛覺過敏的產(chǎn)生[23]。上述結(jié)果表明，P2X7受體參與神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生，阻斷P2X7受體的活化可能是緩解神經(jīng)疼痛的有效方法。小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)的P2X7受體也在小膠質(zhì)細(xì)胞激活和隨后釋放促炎細(xì)胞因子(包括IL-1β和TNF-α)中起關(guān)鍵作用[24]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)慢性低度炎癥在DNP的發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用[5-6]。其中，TNF-α是參與糖尿病神經(jīng)病變的關(guān)鍵炎癥因子[25]。綜上所述，降低P2X7的表達(dá)可以抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，緩解神經(jīng)性疼痛。

本研究發(fā)現(xiàn)，DNP大鼠的機(jī)械痛閾和熱縮足反應(yīng)時(shí)間顯著降低，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中OX42和P2X7表達(dá)水平顯著增加，血清中炎癥遞質(zhì)IL-1β、TNF-α和CCL3的水平也顯著升高。這提示STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠周圍神經(jīng)損傷后，脊髓內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞活性明顯升高并伴隨P2X7表達(dá)水平上調(diào)。益氣活血通絡(luò)方干預(yù)后，機(jī)械痛閾和熱縮足反應(yīng)時(shí)間顯著升高，說明益氣活血通絡(luò)方確實(shí)能改善DNP模型大鼠周圍神經(jīng)的功能，緩解其疼痛癥狀。脊髓組織中OX42和P2X7表達(dá)水平降低，血清TNF-α、IL-1β和CCL3水平亦明顯下降，說明益氣活血通絡(luò)方可通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞活性，下調(diào)P2X7的表達(dá)水平，抑制炎癥因子和趨化因子的釋放，從而改善周圍神經(jīng)損傷并減輕神經(jīng)病理性疼痛。綜合課題組前期和本次的研究結(jié)果，藥物的劑量依賴性趨勢并不顯著[7]，還需進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)研究了中藥復(fù)方益氣活血通絡(luò)方防治DNP的功效和機(jī)制，為下一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等方法進(jìn)一步闡明益氣活血通絡(luò)方干預(yù)DNP提供了有效依據(jù)，為中醫(yī)藥治療糖尿病并發(fā)癥提供科學(xué)依據(jù)和有效選擇。