張 璐，童祥麗，王小樂，朱 潔，李澤庚，，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)呼吸病防治研究所，安徽 合肥 230031)

低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是一種高致殘率和死亡率的肺血管疾病[1]，亦是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要并發(fā)癥，通常以輕度至中度肺血管重塑為特征，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)過度增殖與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白異常沉積導(dǎo)致的血管內(nèi)壁增厚、腔徑狹窄及阻力增加[2-3]?；颊咴诩膊≡缙诳蔁o明顯臨床癥狀，中晚期右心室后負(fù)荷加重，有明顯的呼吸困難癥狀及運(yùn)動(dòng)耐量降低，此時(shí)臨床療效較差，患者的生存率降低[4]。慢性低氧是HPH的主要誘因之一，其導(dǎo)致的肺血管重塑、收縮等在HPH的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[5]。研究[6]表明，肺血管重塑主要表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞異常增殖，與HPH嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，調(diào)控PASMCs的異常增殖狀態(tài)以緩解肺血管重塑是藥物治療HPH的潛在有效策略。

芪白平肺膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，以益氣化痰祛瘀立法。課題組前期研究表明，該方能有效改善COPD患者胸悶、氣喘、呼吸困難等臨床癥狀[7-8]，促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs的凋亡[9]，減輕肺血管重構(gòu)，但其主要作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路在細(xì)胞增殖、凋亡等細(xì)胞功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，該通路的激活或抑制影響下游凋亡相關(guān)因子的活性進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。為此，本研究通過芪白平肺膠囊含藥血清干預(yù)低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs，觀察其對(duì)PI3K/Akt通路關(guān)鍵分子的影響，以探究其治療HPH可能的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0003。飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物飼養(yǎng)室干凈、通風(fēng)，室內(nèi)溫度為(20±2)℃，濕度為(50±2)%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 芪白平肺膠囊組方為黃芪、薤白、生曬參、川芎、葶藶子、五味子、地龍，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)為20190805。將芪白平肺膠囊調(diào)配成溶液，每毫升含芪白平肺膠囊50 mg。

1.3 試劑 PBS、DMEM高糖培養(yǎng)液：美國(guó)HyClone公司；胎牛血清(批號(hào) 2036224C)：美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶(批號(hào) 325043033)：維森特生物技術(shù)(南京)有限公司；兔抗α-SMA抗體(批號(hào) 82687)、FITC-羊抗兔 IgG(批號(hào) 20000235)：武漢三鷹生物科技有限公司；PI3K抑制劑(LY294002)：美國(guó)Selleck公司；DAPI：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)：美國(guó)AbMole公司；兔抗AKT、p-AKT多克隆抗體：美國(guó)Abcam公司；兔抗Bcl-2、Caspase-3多克隆抗體：美國(guó)Santa cruz公司；山羊血清、TritonX-100：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 倒置顯微鏡(型號(hào) CHL2FM3)：日本Olympus公司；多功能酶標(biāo)儀(型號(hào) BioTek Epoch 2)：美國(guó)BioTek公司；三氣培養(yǎng)箱(型號(hào) Series 8000 WJ)：Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 大鼠原代PASMCs提取 無菌條件下快速分離大鼠肺動(dòng)脈，刮去其內(nèi)膜與外膜，取中膜剪成約1 mm2組織塊，平鋪于含20%胎牛血清DMEM的25 mL培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液于瓶底，垂直放置在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，4 h后緩慢放平培養(yǎng)瓶，使組織塊得到充分浸潤(rùn)，3 d后換液，之后每2 d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)采用α平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定，選用4～6代生長(zhǎng)良好的PASMCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 含藥血清的制備 將雄性SD大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組與芪白平肺膠囊組，每組6只。芪白平肺膠囊組參照前期研究[6，10]予每日芪白平肺膠囊溶液灌胃1 g/kg，空白對(duì)照組予同容積生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)9 d。末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈取血，靜置2 h待血液凝固、血清析出后3 000 r/min低溫離心15 min，無菌分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，過濾后保存于-80 ℃冰箱。

2.3 含藥血清濃度及時(shí)間的篩選 將4～6代細(xì)胞消化離心收集后以每孔1×104接種于96孔板，設(shè)立常氧組，低氧組，5%、10%、15%、20%芪白平肺膠囊含藥血清組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。常氧組與低氧組加入空白對(duì)照組大鼠血清，分別在常氧培養(yǎng)箱(20% O2，5% CO2，75% N2)、三氣培養(yǎng)箱(3% O2，5% CO2，92% N2)培養(yǎng)，其余各組加入芪白平肺膠囊含藥血清，于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組分別培養(yǎng)6、12、24、48 h，結(jié)束后每孔加入10 μL的CCK-8溶液于37 ℃繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度(optical density，OD)值，空白孔調(diào)零，重復(fù)3次取平均值，計(jì)算細(xì)胞活力值。細(xì)胞活力=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

2.4 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠PASMCs，根據(jù)CCK-8結(jié)果隨機(jī)分成常氧組與最佳含藥血清組。待預(yù)處理細(xì)胞最佳低氧時(shí)間后，予4%多聚甲醛固定，PBS漂洗2次，加入0.5 mL Hoechst 33258染液，室溫放置5 min，PBS漂洗2次后熒光顯微鏡下觀察。

2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠PASMCs，根據(jù)CCK8結(jié)果隨機(jī)分成常氧組、低氧組、低氧+芪白平肺膠囊含藥血清組、低氧+芪白平肺膠囊含藥血清+LY294002組(終濃度為20 μmol/L)。待預(yù)處理細(xì)胞最佳低氧時(shí)間后，收集細(xì)胞樣本，加入RIPA裂解液冰上裂解，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，收集上清液，在收集的蛋白樣品中按照1∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗Akt、p-Akt、Caspase-3多克隆抗體(稀釋度為1∶1 000)和Bcl-2多克隆抗體(稀釋度為1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶20 000)室溫孵育2 h后再次洗膜。使用ECL發(fā)光試劑盒顯影，曝光后膠片用Image J軟件處理。

3 結(jié)果

3.1 PASMCs的鑒定 FITC標(biāo)記的α平滑肌肌動(dòng)蛋白呈纖維細(xì)絲狀，發(fā)綠色熒光，經(jīng)DAPI染色后的細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。見圖1。

圖1 PASMCs免疫熒光鑒定圖

3.2 最佳低氧時(shí)間、最佳含藥血清濃度的篩選 低氧培養(yǎng)不同時(shí)間后，各時(shí)間段PASMCs的活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，24 h的細(xì)胞活力值最高，故后續(xù)選取24 h作為低氧刺激時(shí)間。與低氧組比較，各芪白平肺膠囊含藥血清組細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)，后續(xù)選取20%含藥血清組作為含藥血清濃度。見圖2。

注：A.低氧組；B.5%芪白平肺膠囊含藥血清組；C.10%芪白平肺膠囊含藥血清組；D.15%芪白平肺膠囊含藥血清組；E.20%芪白平肺膠囊含藥血清組；與低氧6 h組比較，*P<0.05；與低氧組比較，#P<0.05

3.3 Hoechst 33258染色法觀察給藥后PASMCs凋亡情況 PASMCs經(jīng)Hoechst 33258染色后呈正常藍(lán)色，芪白平肺膠囊含藥血清組經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色強(qiáng)光，出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、核碎裂的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。見圖3。

注：A.常氧組；B.低氧+20%芪白平肺膠囊含藥血清組

3.4 芪白平肺膠囊含藥血清對(duì)PASMCs中p-Akt、Akt及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與常氧組比較，低氧組p-Akt、Bcl-2表達(dá)水平升高，Caspase-3表達(dá)水平降低(P<0.05)；與低氧組比較，低氧+芪白平肺膠囊含藥血清組p-Akt、Bcl-2表達(dá)水平降低，Caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)；與低氧+芪白平肺膠囊含藥血清組相比，低氧+芪白平肺膠囊含藥血清+LY294002組p-Akt、Bcl-2表達(dá)水平降低，Caspase-3表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 芪白平肺膠囊含藥血清對(duì)p-Akt、Akt及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

HPH在中醫(yī)古籍中并無記載，依據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)“肺脹”范疇，乃本虛標(biāo)實(shí)之證，“虛、痰、瘀”是其核心病機(jī)[11]。肺氣虧虛累及腎與脾，內(nèi)生痰飲致氣道不利，濁氣郁積形成瘀血；瘀而氣滯，無力行津，化生為痰，或瘀阻脈道致津溢脈外積久成痰，痰瘀互結(jié)，互為因果。方中黃芪、生曬參補(bǔ)脾益肺，川芎行氣活血，薤白理氣通陽，葶藶子瀉肺平喘，地龍清肺定喘，五味子滋補(bǔ)腎陰、斂降肺氣。諸藥合用，共奏益氣溫陽、化痰祛瘀之功。PASMCs的異常增殖是引起肺血管重塑、導(dǎo)致HPH發(fā)生的重要原因。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，芪白平肺膠囊含藥血清可顯著促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs凋亡，提示其可能通過凋亡途徑，改善低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖。為此，筆者進(jìn)一步觀察了芪白平肺膠囊對(duì)低氧誘導(dǎo)的大鼠PASMCs凋亡相關(guān)蛋白的影響。

研究[12-13]表明，Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡機(jī)制密切相關(guān)，其中抗凋亡蛋白Bcl-2的異常表達(dá)是凋亡發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。位于膜表面的Bcl-2有調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放的作用，在凋亡信號(hào)刺激下，Bcl-2的異常表達(dá)促使其不可逆的過度開放，破壞細(xì)胞膜完整性，釋放出促凋亡因子。Caspase家族啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[14-15]。其中Caspase-3蛋白是凋亡的最終執(zhí)行者，有終止DNA修復(fù)的功能。本研究結(jié)果表明，大鼠PASMCs低氧24 h后的Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低。而芪白平肺膠囊含藥血清處理后Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，這表明芪白平肺膠囊含藥血清通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的PASMCs凋亡。

PI3K/Akt信號(hào)通路的激活或抑制與血管生成密切相關(guān)[16-17]，活化的PI3K可部分或完全激活下游靶點(diǎn)Akt，活化的Akt影響下游Bcl-2家族蛋白及Caspase-3等蛋白的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡[18-19]。多項(xiàng)研究表明，PI3K/Akt通路參與改善肺血管重構(gòu)。Zhang等[20]指出，PI3K/Akt信號(hào)通路參與化合物香芹酚促進(jìn)低氧條件下PASMCs凋亡、減弱肺血管重構(gòu)的過程。Xia等[21]發(fā)現(xiàn)，賴氨酰氧化酶的表達(dá)在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠中呈現(xiàn)出PI3K/Akt依賴性，給予抑制劑處理后肺血管重構(gòu)得到明顯改善。Chen等[22]證實(shí)，中藥卷柏分離出的有效活性成分總黃酮，通過PI3K/Akt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)慢性低氧引起的氣道平滑肌細(xì)胞過度增殖與凋亡減少。本研究結(jié)果表明，低氧組PASMCs中p-Akt值高于常氧組，表明低氧激活HPH中PI3K/Akt信號(hào)通路。低氧+芪白平肺含藥血清組較低氧組p-Akt表達(dá)水平降低，低氧條件下芪白平肺含藥血清+LY294002組p-Akt表達(dá)水平較不使用抑制劑組下降，且抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯下降，促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)水平顯著上調(diào)。這表明芪白平肺膠囊含藥血清可能通過抑制低氧狀態(tài)下PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，部分逆轉(zhuǎn)低氧條件下PASMCs凋亡的減少，改善HPH中肺血管重構(gòu)。

綜上所述，芪白平肺膠囊含藥血清對(duì)低氧大鼠PASMCs凋亡有明顯的促進(jìn)作用，該作用由PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)。