章 娟，趙宏蘇，陳慧芳，熊俊偉，徐少君，張 偉，3，吳德玲，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽 安慶 246052；3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序[1]，主要含有黃酮類、揮發(fā)油、苯丙素類、萜類、氨基酸等成分，其中黃酮類和苯丙素類化合物為菊花的主要藥效成分[2-7]。菊花總黃酮作為藥用菊花的主要活性成分[8]，與菊花的傳統(tǒng)功效密切相關(guān)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[9-13]表明，菊花總黃酮具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗糖尿病等作用，此外對心血管也有一定的作用，其含量高低是評價中藥菊花質(zhì)量優(yōu)劣的重要依據(jù)。2020年版《中華人民共和國藥典》[1]按產(chǎn)地和加工方法不同，將菊花分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”“懷菊”等品種。9—11月花盛開時分批采收，陰干或焙干，或熏、蒸后曬干，其炮制目的在于“殺酶保苷”。前期實驗研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，β-D-葡萄糖苷酶可以水解亳菊中黃酮苷類成分，并且β-D-葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮是烘干過程中黃酮苷元含量升高的原因之一。而不同品種菊花中多種黃酮苷類成分均是β-D-葡萄糖-O-苷，考慮β-D-葡萄糖苷酶可用于水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。因此，本實驗基于“殺酶保苷”的炮制目的，研究β-D-葡萄糖苷酶對5種菊花黃酮類成分的影響，探究β-D-葡萄糖苷酶在5種藥用菊花加工炮制中的作用，為不同品種藥用菊花的加工方法提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-2030C 3D液相色譜儀：美國ABSCIEX公司；BSA224S十萬分之一電子分析天平：賽多利斯；F80型高速多功能粉碎機(jī)：玖藍(lán)五金制品有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇國勝實驗儀器廠；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；PALL超純水機(jī)：美國Milipore公司。

1.2 試藥 乙腈為色譜純：歐普森；甲酸為分析純：上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；超純水：PALL超純水機(jī)；芹菜素(批號 PS010177)、芹菜苷(批號 PS011186)、木犀草素(批號 PS010346)、木犀草苷(批號 PS000708)、金合歡素(批號 PS011043)、香葉木素(批號 PS010395)、香葉木苷(批號 PS011578)：均購于成都普思生物科技股份有限公司，純度均大于98.0%；β-D葡萄糖苷酶(7.4 U/mg)：sigma公司；實驗樣品為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊、懷菊，分別采收于安徽亳州、安徽滁州、安徽黃山、浙江桐鄉(xiāng)、河南焦作，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為菊科植物亳菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘boju’cv.nov.、滁菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘chuju’cv.nov.、貢菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘gongju’cv.nov.、杭菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘hangju’cv.nov.、懷菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘huaiju’cv.nov.的干燥頭狀花序。

2 方法

2.1 色譜條件 Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脫(0～8 min，5%～10% A；8～15 min，10%～14% A；15～18 min，14%～17% A；18～22 min，17%～17.5% A；22～35 min，17.5%～18% A；35～40 min，18% A；40～50 min，18%～19% A；50～65 min，19%～30% A；65～80 min，30%～52% A)；檢測波長：348 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃?；旌蠈φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤焊咝б合嗌V圖見圖1。

注：1.木犀草苷；2.芹菜苷；3.香葉木苷；4.木犀草素；5.芹菜素；6.香葉木素；7.金合歡素

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取木犀草苷、芹菜苷、香葉木苷、香葉木素、芹菜素、木犀草素、金合歡素對照品適量，用70%甲醇定容，制成每毫升含有木犀草苷0.195 mg、芹菜苷0.205 mg、香葉木苷0.210 mg、木犀草素0.125 mg、芹菜素0.238 mg、香葉木素0.188 mg、金合歡素0.188 mg的對照品溶液。

2.3 菊花提取物溶液的制備 取菊花樣品粉末(過一號篩)0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率45 Hz)40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 供試品溶液的制備 分別將各菊花提取物，減壓蒸干，用100 mmol/L、pH 4.0的檸檬酸緩沖溶液定容，制成每毫升含6 mg菊花提取物的底物溶液。將底物溶液放在50 ℃水浴鍋中孵育，待其完全溶解，迅速精密吸取0.2 mL的底物溶液與等量的β-D-葡萄糖苷酶溶液于1.5 mL的離心管中混合，分別在4 ℃、50 ℃、100 ℃條件下水浴反應(yīng)1 h后，加入1 mL甲醇終止反應(yīng)?；靹蚝?，8 000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 含量測定

2.5.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.2”項下制備的對照品溶液，用70%甲醇逐級稀釋成2、4、8、16、32、64、128、256倍溶液，搖勻，配成混合對照品溶液。分別進(jìn)樣10 μL，注入高效液相色譜儀中，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積的積分為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。見表1。

表1 線性回歸方程

2.5.2 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測定。測得木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素的精密度的RSD值分別為1.06%、1.02%、1.08%、1.14%、1.01%、1.16%、1.08%，說明儀器性能良好，精密度實驗結(jié)果符合有關(guān)要求。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品6份，按照“2.3”項下方法處理，在上述色譜條件下測定，測定峰面積積分值，計算RSD。木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素峰面積RSD(n=6)分別為0.78%、2.05%、0.57%、1.14%、0.53%、1.04%、0.57%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取上述混合對照品溶液10 μL，分別于0、2、8、10、12、24 h進(jìn)樣，共6次，由峰面積值統(tǒng)計結(jié)果計算穩(wěn)定性的相對峰面積的RSD值分別為1.44%、0.22%、0.85%、0.28%、1.01%、0.79%、0.15%。結(jié)果表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知含量的菊花樣品，精密稱取6份，每份0.125 g。分別精密加入高、中、低濃度的木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述高效液相色譜條件下進(jìn)行測定，計算回收率。結(jié)果表明，木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素和金合歡素的平均回收率分別為97.14%、97.52%、98.72%、99.47%、98.24%、98.33%、99.41%，RSD(n=6)分別為1.30%、1.41%、2.65%、1.52%、1.95%、1.11%、1.06%。

2.5.6 5種藥用菊花含量測定 按“2.3”“2.4”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算5種菊花樣品提取物及經(jīng)不同加工處理后的成分含量，結(jié)果見表2。

表2 5種藥用菊花加工后多指標(biāo)成分含量(μg/mL，n=3)

3 結(jié)果與分析

實驗結(jié)果表明，5種菊花中木犀草苷、香葉木苷和芹菜苷的含量在40 ℃和100 ℃的條件較高，而木犀草素、香葉木素、芹菜素、金合歡素的含量在50 ℃的條件下較高，4 ℃和100 ℃的條件下含量較低，除了亳菊和滁菊中的芹菜素在4 ℃條件下含量最高外，總體上呈現(xiàn)一個共性規(guī)律，符合“殺酶保苷”的炮制目的。β-D-葡萄糖苷酶活性受溫度影響較大，低溫時酶活性較低，隨著溫度升高，酶活性增大，但溫度過高又可能使酶變性[15]。50 ℃酶活性較大，β-D-葡萄糖苷酶水解黃酮苷類成分，從而導(dǎo)致苷元類成分木犀草素、香葉木素、芹菜素、金合歡素含量升高，而4 ℃和100 ℃時酶活力較低，4 ℃時酶活性被抑制，100 ℃時酶被滅活，與激活酶組(50 ℃)相比，抑制酶(4 ℃)或滅活酶組(100 ℃)水解反應(yīng)被抑制，因此木犀草苷等黃酮苷類成分含量升高，與之對應(yīng)的苷元類成分含量降低。

由于菊花品種、生長環(huán)境、氣候、土壤等不同，不同菊花之間總黃酮含量存在差異(見圖2)。不同菊花經(jīng)過不同加工方法處理，抑制、激活或滅活酶水解總黃酮后，得到的木犀草苷、木犀草素、芹菜苷、芹菜素、香葉木苷、香葉木素、金合歡素這7種黃酮類成分總量也存在差異(見圖3)。通過實驗結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在50 ℃條件下黃酮苷總量較低，但總黃酮含量較高(除金合歡素)。酶在被抑制狀態(tài)(4 ℃)和滅活狀態(tài)(50 ℃)菊花中黃酮苷含量較高，酶被激活狀態(tài)(50 ℃)時，菊花中黃酮苷被水解，黃酮苷含量降低，黃酮苷元含量升高。與4 ℃和100 ℃條件下比較，50 ℃條件下測得的黃酮類化合物總量較高，推測在50 ℃條件下導(dǎo)致其他苷轉(zhuǎn)化成木犀草素等苷元，從而使得所測得的黃酮類成分總量升高。與酶活性被抑制狀態(tài)(4 ℃)相比，除杭菊外，絕大多數(shù)菊花在滅活酶條件下(100 ℃)測得的黃酮苷類成分總含量較高。

圖2 5種藥用菊花不同溫度處理后的黃酮類成分含量變化圖

注：A.亳菊4 ℃；B.亳菊50 ℃；C.亳菊100 ℃；D.滁菊4 ℃；E.滁菊50 ℃；F.滁菊100 ℃；G.貢菊4 ℃；H.貢菊50 ℃；I.貢菊100 ℃；J.杭菊4 ℃；K.杭菊50 ℃；L.杭菊100 ℃；M.懷菊4 ℃；N.懷菊50 ℃；O.懷菊100 ℃

4 討論

研究表明，體外烘干過程中β-D葡萄糖苷酶可酶解亳菊中黃酮類成分，且在水浴50 ℃下反應(yīng)最完全[16]。而左亞峰等[14]也從亳菊中分離純化得到β-D-葡萄糖苷酶，并證明其在體內(nèi)水解與體外水解一致，推測出β-D-葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮是烘干過程中黃酮苷元含量升高的原因之一。且β-D-葡萄糖苷酶的活性受溫度影響較大[15]。

實驗通過對比了不同溫度條件時，5種菊花提取物在β-D-葡萄糖苷酶作用下的7種黃酮類化合物(木犀草苷及苷元、芹菜苷及苷元、香葉木苷及苷元、金合歡素)，發(fā)現(xiàn)不同藥用菊花在β-D-葡萄糖苷酶作用下均會發(fā)生黃酮苷水解，從而苷元含量升高，這與傳統(tǒng)加工過程中“殺酶保苷”的炮制目的一致。

2020年版《中華人民共和國藥典》[1]中規(guī)定木犀草苷為質(zhì)量評價的標(biāo)準(zhǔn)之一。通過實驗觀察對比發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫時(抑制或滅活酶)條件下，5種菊花中木犀草苷含量較高，因此控制藥材的加工溫度對藥材質(zhì)量要求有一定的意義。后期將以傳統(tǒng)菊花加工炮制過程中殺(抑)酶保苷的共性規(guī)律為切入點，系統(tǒng)研究5種菊花中自身酶在菊花炮制加工中的作用，為制定合理的菊花現(xiàn)代加工炮制工藝提供依據(jù)。