李巧玲， 任明波， 曹 然， 安 杰， 楊小玉， 章文偉， 李品明

(重慶市藥物種植研究所 重慶市道地藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心， 重慶 南川 408435)

植物內(nèi)生菌是一類生長在植物體內(nèi)而不引起任何癥狀的微生物類群。研究表明，內(nèi)生菌有多種重要的生物學作用，如促生[1]、固氮[2]及誘導抗性[3]等。此外，有些內(nèi)生菌甚至能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)，如合成生長素、酶、生物堿等，已被廣泛應用于食品、生物燃料、生物農(nóng)藥等一些產(chǎn)品的制造中[4]。近年來，植物內(nèi)生菌作為一種廣泛存在的微生物資源，引起了學者們的極大關(guān)注。張鵬等[5]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)為七葉一枝花根內(nèi)生細菌的優(yōu)勢菌屬，促生實驗發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬菌株SCR21024對小麥幼苗有較強的促生作用。曾波等[6]對兩種天南星內(nèi)生細菌進行了分離，成功篩選到兩株軟腐病拮抗菌。邵金華等[7]采用組織塊法從博落回的根、莖、葉中共分離出10株內(nèi)生細菌，其中3株內(nèi)生細菌可產(chǎn)生物堿，這是首次從博落回植株中分離得到的有效菌株，為后續(xù)博落回內(nèi)生菌資源的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。目前有關(guān)植物內(nèi)生菌的報道涉及馬鈴薯[8]、辣椒[9]、番茄[10]等30多種農(nóng)作物和20多種雜草，在人參[11]、重樓[12]、三七[13]等多種中藥材中也發(fā)現(xiàn)了植物內(nèi)生菌。因此，對特色藥用植物內(nèi)生菌進行深入研究，挖掘功能菌株，開發(fā)生物農(nóng)藥、肥料及生物活性化合物，對特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。淫羊藿屬(EpimediumL.)隸屬于被子植物門小檗科(Berberidaceae)，該屬植物種類繁多，全世界分布約41個種。淫羊藿是我國重要的草本植物，在中藥、功能性藥品和園林觀賞等領(lǐng)域都具有重要用途[14]。中藥淫羊藿和巫山淫羊藿均來自該屬植物，兩者都具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，用于腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛、麻木拘攣等癥狀[15]。重慶地處西南，淫羊藿野生資源豐富，故研究其內(nèi)生菌，對淫羊藿產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要的理論和現(xiàn)實意義。目前，對于淫羊藿內(nèi)生細菌群落多樣性的研究還處于空白狀態(tài)，本研究選用三種淫羊藿為實驗材料，通過構(gòu)建16S rDNA克隆文庫對淫羊藿葉片內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行差異分析，旨在明確淫羊藿葉片中的優(yōu)勢及特有內(nèi)生細菌，為淫羊藿品質(zhì)的提升及有益內(nèi)生細菌的綜合開發(fā)及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 樣品采自重慶市藥物種植研究所淫羊藿林下栽培基地(107°12′14.04″E，29°7′58.46″N)，海拔584 m的砂壤土栽培的淫羊藿。于2020年3月22日(晴天)上午，分別采集淫羊藿展葉盛期的粗毛淫羊藿(EpimediumacuminatumFranch.)新葉(AY)以及老葉(AO)、箭葉淫羊藿(EpimediumsagittatumMaxim.)新葉(BY)和老葉(BO)以及巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseYing)新葉(CY)和老葉(CO)各3株兩年生新鮮無病蟲害的當年生新葉和去年生老葉，每個處理重復3次，樣品采集后置于無菌自封袋中，迅速帶回實驗室于12 h內(nèi)進行表面消毒處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，加雙蒸水至1 000 mL， 用5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.2，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑與儀器 Plant DNA Isolation Reagent植物DNA提取試劑盒(上海寶生物工程有限公司)；膠回收試劑盒(賽默飛世爾科技公司有限公司)；無水乙醇、0.1%升汞，(重慶鼎國生物技術(shù)有限責任公司)。立式蒸汽高壓滅菌鍋(YXQ-100A，上海博訊實業(yè)有限公司)；高速離心機(KH20R-II，湖南凱達科學儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(S-CH-6A，上海舍巖儀器有限公司)；電泳儀(BG-Power300，成都比朗儀器有限公司)；超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop DUO+，杭州恒流科技有限公司)；PCR儀(T100，美國Bio-Rad伯樂上海凌儀生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 三種淫羊藿葉片表面用蒸餾水清洗干凈，濾紙吸干表面水分。用75%乙醇浸泡樣品40 s，然后0.1%升汞表面消毒15 min，最后用無菌水反復沖洗5～8次，用無菌濾紙吸干表面水分。移液槍吸取最后一次沖洗的無菌水200 μL，涂布LB培養(yǎng)基作為空白對照，重復3次，觀察是否有菌落產(chǎn)生，作為評判樣本表面是否消毒徹底的指標[16]。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增及測序 表面消毒后的淫羊藿葉片采用Plant DNA Isolation Reagent提取總DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核酸分光光度計檢測DNA濃度和純度，并將樣品稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，采用細菌通用引物338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增細菌16S rDNA V3+V4區(qū)域。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用Thermo Scientific公司的膠回收試劑盒對目標片段進行回收?；厥债a(chǎn)物稀釋至20 pmol/L后上機測序，委托北京奧維森基因科技有限公司完成后續(xù)高通量測序。

1.2.3 序列處理與分析 高通量測得的原始序列經(jīng)過雙端拼接、過濾、去除嵌合體、去除宿主線粒體和葉綠體序列，得到優(yōu)化序列；然后將優(yōu)化序列在97%的相似度水平下進行聚類，獲得OTUs(operational taxonomic units)，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類?；贠TU分析結(jié)果，通過α多樣性分析、β多樣性分析及差異優(yōu)勢菌群等分析，評估3種淫羊藿內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異，揭示3種淫羊藿內(nèi)生細菌的群落組成。采用Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)方差分析及多樣性指數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及OTU豐度

從表1看出，6組樣品測序共獲得1 056 219條原始序列，原始序列經(jīng)拼接、過濾后共產(chǎn)生1 017 098條有效序列，每個樣品至少產(chǎn)生169 517條有效序列。對有效序列在97%的相似度水平下進行聚類、獲得每個時期樣品的OTU數(shù)，6組樣品共產(chǎn)生4 848個OTU，其中，CO的OTU最多，為512個，AY的OTU最少，為158個。從圖1看出，6組樣本共有的OTU數(shù)目為94個，AO、AY、BO、BY、CO、CY特有的OTU數(shù)目分別為29、16、42、56、341和45個，其余OTU為樣本兩兩共有。其中，CO樣本中特有的OTU數(shù)目最多，預示著巫山淫羊藿老葉中存在較多的特有微生物種類。

表1 各樣品內(nèi)生細菌的高通量測序數(shù)據(jù)及OTU量

2.2 優(yōu)勢內(nèi)生細菌群落組成分析

不同淫羊藿葉片內(nèi)生細菌在門水平上排名前十的群落組成如圖2所示，6組樣品中的優(yōu)勢菌群主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)及芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，占總細菌數(shù)的98%以上，但各菌群在在每組樣品中所占的比例稍有差異。其中，變形菌門相對豐度最高，占6個樣品中的比例分別為81.89%、87.50%、67.61%、57.12%、60.87%和71.68%；其次為厚壁菌門，所占比例分別為5.69%、6.99%、18.98%、34.52%、10.85%和22.26%；放線菌門相對豐度依次為9.24%、3.52%、7.29%、4.98%、7.61%及3.44%，而其他菌類相對豐度較低，如軟壁菌門(Tenericutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、衣原體門(Chlamydiae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)等。不同種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌的群落組成及相對豐度有一定的差異，其中，CO樣品物種組成最為豐富，在門水平上的物種種類最多；變形菌門在粗毛淫羊藿樣品中占優(yōu)勢，在箭葉淫羊藿和巫山淫羊藿中則明顯占劣勢；厚壁菌門則在箭葉淫羊藿和巫山淫羊藿的新葉樣品中占絕對優(yōu)勢。結(jié)果表明，不同淫羊藿葉片內(nèi)生細菌群落組成各不相同，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門為三大優(yōu)勢菌群，三者豐度之和達73%以上，而其他細菌類群為非優(yōu)勢菌群。

圖1 不同區(qū)組內(nèi)生細菌OTUs韋恩圖Fig.1 OTUs Venn diagram of endophytic bacteria in different compartments

圖2 門水平淫羊藿樣品內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.2 Structure and distribution of microbial community at phylum level of different samples

由圖3可以看出，6組淫羊藿葉片內(nèi)生細菌在屬水平上豐度較高的菌主要有甲基桿菌屬(Methylobacterium)、鞘氨醇單孢菌屬(Sphingomonas)、放線孢菌屬(Actinomycetospora)、Kroppenstedtia屬、泛菌屬(Pantoea)及乳桿菌屬(Lactobacillus)等。各樣品的優(yōu)勢菌屬(相對豐度>5%)存在一定差異，如在粗毛淫羊藿樣品中甲基桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬相對豐度較其余樣品高(相對豐度不足2%)，而Kroppenstedtia屬在箭葉淫羊藿樣品中的相對豐度較高，乳桿菌屬、魏斯式菌屬(Weissella)、馬賽菌屬(Massilia)和泛菌屬的相對豐度則在巫山淫羊藿樣品中的豐度較高。

由圖4可以看出，3種淫羊藿老葉和新葉優(yōu)勢內(nèi)生細菌(相對豐度>5%)在屬水平上相對豐度差異較大，如在粗毛淫羊藿葉片中，甲基桿菌屬和Kroppenstedtia屬在老葉中的相對豐度較高，而乳桿菌屬、魏斯式菌屬和泛菌屬在新葉中相對豐度較高；箭葉淫羊藿，甲基桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬和馬賽菌屬在老葉中的相對豐度較高，而Kroppenstedtia屬和泛菌屬相對豐度顯著低于新葉；在巫山淫羊藿樣品中，甲基桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、Kroppenstedtia屬和馬賽菌屬在老葉中的相對豐度較高，而乳桿菌屬、魏斯式菌屬和泛菌屬在新葉中相對豐度較高，這些結(jié)果達到高度一致，這些菌的存在是否與其生長或物質(zhì)合成有關(guān)，還需要做進一步的驗證。

圖3 屬水平淫羊藿樣品內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.3 Structure and distribution of microbial community at genus level of different samples

圖4 3種淫羊藿老葉和新葉優(yōu)勢內(nèi)生細菌分析Fig.4 Analysis of dominant endophytic bacteria in the old and new leaves of three Epimediums

2.3 3種淫羊藿葉片優(yōu)勢內(nèi)生細菌的差異分析

以3種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌類群為對象，使用LEfSe分析不同淫羊藿葉片內(nèi)生細菌群落中主要差異物種(LDA Score預設(shè)值3.0，高于3.0視為有顯著差異)(圖5)。圖5中LDA Score的絕對值代表了差異物種的影響大小，LDA值越大，代表菌群差異性越大。分析結(jié)果表明，不同種淫羊藿內(nèi)生細菌在新老葉片中均存在有統(tǒng)計學差異的物種，甲基桿菌科(Methylobacteriaceae)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、鞘氨醇單孢菌屬等細菌群落在AO樣品中相對豐度較高；α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和甲型變形菌綱(Alphaproteobacteria)在AY樣品中相對豐度較高；嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和Marinilabiaceae科等在BO樣品中存在豐富；而γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、莫拉菌科(Moraxellaceae)和梭菌綱(Clostridia)等在BY樣品中相對豐度較高；在CO樣品中的物種最為豐富，其中包括黃單胞菌目(Xanthomonadales)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和氣單胞菌科(Aeromonadaceae)等細菌類群。

2.4 優(yōu)勢內(nèi)生細菌的功能分析

對3種淫羊藿葉片優(yōu)勢內(nèi)生細菌的功能進行統(tǒng)計(表2)。3種淫羊藿內(nèi)生細菌的優(yōu)勢益生菌群落結(jié)構(gòu)略有差異，主要集中在變形菌門、厚壁菌門和放線菌門所屬的13個屬中，其功能主要體現(xiàn)在促進土壤有機物的分解、固氮解磷促生長、合成多種次級代謝產(chǎn)物、誘導作物對病原微生物的抗性等方面。這些淫羊藿內(nèi)生細菌的功能信息，將為淫羊藿的高效栽培及有效成分的生物合成提供參考依據(jù)。

表2 3種淫羊藿葉片優(yōu)勢內(nèi)生菌群功能分析

圖5 淫羊藿葉片內(nèi)生細菌LEfSe分析Fig.5 LEfSe analysis of endophytic bacteria in leaves of Epimedium

2.5 多樣性分析

2.5.1 α多樣性分析 稀釋曲線可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與其所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線(rarefaction curve)，當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合理。各樣品在相似度為97%水平下的稀釋曲線見圖6，由圖6可知，每組樣品稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明樣品序列充分、取樣合理，可以用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。α多樣性反映樣品內(nèi)物種豐度(richness)及物種多樣性(diversity)，本研究使用Mothur(version v.1.30)軟件，對樣品α多樣性指數(shù)進行了評估。Chao1指數(shù)為物種豐度指數(shù)，用以估計群落中的OTU數(shù)目。observed_species指實際觀測到OTU的個數(shù)。Simpson、PD_whole_tree和Shannon指數(shù)為物種多樣性指數(shù)，其中PD_whole_tree和Shannon指數(shù)的數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)越小，物種多樣性越高。從3種淫羊藿葉片樣品α多樣性指數(shù)分析結(jié)果(表2)可以看出，CO樣本中的OTU數(shù)、observed_species、PD_whole_tree、Shannon及chao1指數(shù)值均最高，顯著高于其他樣品，同時simpson指數(shù)值最小，說明巫山淫羊藿老葉中內(nèi)生細菌群落的物種多樣性和豐度均顯著高于其他樣品。

圖6 相似度為97%水平下各樣品的稀釋曲線Fig.6 Rarefaction curves of each sample at cutoff level of 97%

表3 3種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌多樣性指數(shù)分析

2.5.2 β多樣性分析 使用QIIME軟件進行β多樣性分析，比較了3種淫羊藿老葉和新葉內(nèi)生細菌群落物種多樣性相似度。主坐標PCoA分析(圖7a)和非度量多維標定法(NMDS)分析(圖7b)結(jié)果表明，CO樣品在坐標圖上的距離最遠，均分布于同一象限內(nèi)，其他樣品分布于其他坐標軸內(nèi)，未完全分開，說明這些樣品相似性較高，細菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。

圖7 3種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌的PCoA分析(a)和NMDS分析(b)Fig.7 PCoA analysis (a) and NMDS analysis (b) of endophytic bacteria in leaves of Epimedium

用非加權(quán)配對平均法(UPGMA)對樣品進行屬水平聚類，判斷3種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌群落組成相似性。樣品屬水平的聚類樹如圖8?？傮w分為兩類，AO、AY、BO、BY和CY樣品聚為一類，CO樣品單獨聚為另一類，說明巫山淫羊藿在老葉時期的內(nèi)生細菌群落組成與其他兩種淫羊藿差異較大。

圖8 淫羊藿葉片內(nèi)生細菌屬水平的UPGMA聚類分析Fig.8 UPGMA cluster analysis of endophytic bacteria in leaves of Epimedium

3 討 論

內(nèi)生菌對藥用植物的生長發(fā)育、藥材道地性、藥效物質(zhì)的形成和積累等都具有重要影響[30-31]，因此，深入研究藥用植物內(nèi)生菌的種群結(jié)構(gòu)以及生物學功能具有重要意義。本研究采用高通量測序技術(shù)，首次分析了粗毛淫羊藿、箭葉淫羊藿及巫山淫羊藿3種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)和組成。群落組成結(jié)果顯示，3種淫羊藿葉片內(nèi)生優(yōu)勢菌群主要包括變形菌門、厚壁菌門和放線菌門，優(yōu)勢菌屬主要有甲基桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、放線孢菌屬、Kroppenstedtia屬、泛菌屬及乳桿菌屬等。前人研究表明，變形菌、放線菌及鞘氨醇單孢菌屬等細菌有助于藥用植物產(chǎn)量及有效物質(zhì)含量的提高，在促生長、防病害等方面發(fā)揮著重要作用[32]，因此，淫羊藿中豐富的內(nèi)生細菌可為功能菌株的挖掘奠定良好的前期基礎(chǔ)。植物內(nèi)生細菌是一類定殖在植物內(nèi)部的細菌，其種類組成和結(jié)構(gòu)變化會受到植物種類、生長狀況和外界環(huán)境的影響[33]。劉元等[34]比較分析了懷山藥和菜山藥根莖內(nèi)生細菌譜的差異，發(fā)現(xiàn)懷山藥內(nèi)生菌多樣性要大于菜山藥，且菌落組成比菜山藥均勻。孫占斌等[35]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜初花期內(nèi)生菌含量是結(jié)瓜期的5倍，兩時期內(nèi)生菌的種類表現(xiàn)出很強的差異。在本研究中各樣品的優(yōu)勢菌屬(相對豐度>5%)存在一定差異，如在粗毛淫羊藿樣品中甲基桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬相對豐度較其余樣品高(相對豐度不足2%)，而Kroppenstedtia屬在箭葉淫羊藿樣品中的相對豐度較高，乳桿菌屬、魏斯式菌屬、馬賽菌屬和泛菌屬的相對豐度則在巫山淫羊藿樣品中的相對豐度較高；同時，3種淫羊藿新葉和老葉內(nèi)生細菌群落組成也存在差異，甲基桿菌屬、鞘氨醇單孢菌屬、Kroppenstedtia屬和馬賽菌屬在老葉中的相對豐度較高，而乳桿菌屬、魏斯式菌屬和泛菌屬在新葉中相對豐度較高，這些結(jié)果與前人研究相吻合。

內(nèi)生菌與宿主在長期協(xié)同進化的過程中形成了互惠共生的關(guān)系，宿主可以為內(nèi)生菌的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)，而內(nèi)生菌則通過合成次生代謝產(chǎn)物幫助宿主抵御不良環(huán)境，促進作物生長[36]。本研究對3種淫羊藿葉片優(yōu)勢內(nèi)生菌的功能進行分析，發(fā)現(xiàn)這些微生物能夠促進土壤有機物分解，合成多種次級代謝產(chǎn)物，誘導作物對病原微生物的抗性等，如鞘氨醇單孢菌屬可以促進有機物的分解，合成某些有機化合物，抑制病原菌生長；馬賽菌屬能夠合成多種次級代謝產(chǎn)物和酶，而且具有溶磷、降解菲和耐受重金屬等多種功能；根瘤菌屬在土壤中具有較強的固氮能力，促進植物對氮源的吸收和利用，說明3種淫羊藿葉片中有豐富的益生菌，這些內(nèi)生菌可能參與代謝葉片內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)，為植株的生長發(fā)育提供必要的營養(yǎng)和激素等。

本研究首次采用高通量測序技術(shù)分析，明確了3種淫羊藿葉片內(nèi)生細菌的群落多樣性及其組成，為今后淫羊藿內(nèi)生細菌的分離、功能菌株的挖掘及病蟲害防控提供了參考。但是，本研究僅對同一產(chǎn)地、單一部位的內(nèi)生細菌群落組成進行了分析，缺少野生種源、不同產(chǎn)地及不同組織內(nèi)生菌的比較分析，同時缺少對其內(nèi)生真菌多樣性的分析，有待今后進一步研究。