欒麗霞,延佳佳,楊 洋,陳國平,劉 燕,王穩(wěn)瑩*

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710077；2解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科；3西安市人民醫(yī)院，西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心；*通訊作者,E-mail:563694923@qq.com)

在我國,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指與同一性伴侶連續(xù)3次及以上妊娠28周之前的胎兒丟失,發(fā)病率約占育齡期婦女的5%[1]。排除染色體異常、解剖、內(nèi)分泌等已知因素外,雖經(jīng)過大量研究,仍有近50%的患者病因不明,RSA對育齡女性的身心健康造成嚴(yán)重影響。研究表明,滋養(yǎng)細(xì)胞功能異常可導(dǎo)致多種妊娠并發(fā)癥[2]。microRNA(miRNA)為一種非編碼小分子RNA,在調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞周期、腫瘤等有著重要作用。目前研究證實,miR-30a-3p在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào),發(fā)揮抑癌作用,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和胚胎發(fā)育等過程[3-5]。而具有浸潤能力的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為與腫瘤細(xì)胞有很多相似之處。為此,本研究通過分析RSA患者絨毛組織中miR-30a-3p的表達(dá)水平及其對人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8)凋亡和遷移功能的影響,以探討其在RSA發(fā)生過程中的相關(guān)作用機(jī)制,為該疾病的診斷和治療提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2020年4月至2021年4月在我院婦科門診正常妊娠自愿終止者20例為正常組,同期早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(自然受孕)行流產(chǎn)絨毛送檢的20例患者為RSA組。RSA組患者需排除由染色體、解剖異常、內(nèi)分泌等因素導(dǎo)致的流產(chǎn),且既往有過早期自然流產(chǎn)至少2次。正常早孕妊娠標(biāo)準(zhǔn):既往無自然流產(chǎn)史與異常生育史;此次妊娠后無發(fā)熱、陰道流血等明顯不適;術(shù)前檢查未發(fā)現(xiàn)病原體感染,超聲檢查見原始心管搏動,未見宮腔積液等。本研究經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(XYYFY 2021LSKY-044),兩組婦女均簽署知情同意書。兩組患者均為孕7～12周,RSA組平均年齡為(30.4±3.2)歲,正常組平均年齡為(28.7±3.0)歲,兩組患者孕周及年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 細(xì)胞株及主要儀器、試劑

人正常滋養(yǎng)細(xì)胞系(HTR-8)購買于中國細(xì)胞庫(ATCC),胎牛血清(FBS)、DMEM-F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;細(xì)胞周期、凋亡試劑盒購自凱基生物公司;miR-30a-3p前體分子,包括miR-30a-3p模擬物(miR-30a-3p mimic)、miR-30a-3p抑制物(miR-30a-3p inhibitor)以及羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的miR-30a-3p空白載體(NC)購自廣州銳博生物技術(shù)公司;Lipofectamine2000購自Invitrogen公司(美國);PCR引物由北京奧科公司合成;反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑均購自TaKaRa公司(日本)。

1.3 標(biāo)本收集及RNA提取

RSA組及正常組患者均在清宮術(shù)后收取絨毛組織,生理鹽水反復(fù)漂洗,無菌眼科剪剪成約0.5 m3大小。TRIzol試劑提取絨毛組織RNA,紫外分光光度儀測定RNA的濃度及純度,而后1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.4 qRT-PCR檢測兩組絨毛組織中miR-30a-3p的表達(dá)水平

采用TaKaRa公司的PrimeScript TMRT為cDNA,按說明書配置RNA反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)體系:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共40個循環(huán);miR-30a-3p和內(nèi)參照U6的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物,試驗設(shè)計分為3組:miRNA組、對照組(U6)和空白組,3個復(fù)孔,表達(dá)水平采用相對定量2-ΔΔCt方法計算得出。miR-30a-3p及U6引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將HTR-8細(xì)胞系解凍后接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,放置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中;待細(xì)胞生長密度至70%左右時行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。按LipofectamineTM 2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。實驗分為3組:miR-30a-3p模擬物組(mimic組)、miR-30a-3p抑制物組(inhibitor組)、陰性對照組(NC組)。將轉(zhuǎn)染液逐一加入到對應(yīng)孔徑中,并設(shè)置陰性對照,隨即將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱,并于6 h后換液為含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液;隨即于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率、記錄結(jié)果。

1.6 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后HTR-8細(xì)胞中miR-30a-3p的表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h用TRIzol Reagent法提取HTR-8細(xì)胞總RNA,測定RNA質(zhì)量后保存。按照表1的基因序列進(jìn)行PCR,按1.4中方法計算各組中(分組同1.5)目的基因miR-30a-3p的相對表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞凋亡測定

取對數(shù)生長期的HTR-8細(xì)胞接種于6孔板,收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞(分組同1.5),將細(xì)胞重懸于Annexin Ⅴ-FITC緩沖液中,稀釋細(xì)胞至1×106個/ml;室溫下孵育15 min,最后加入5 μl碘化丙啶(PI),輕輕混勻。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,每組實驗重復(fù)3次。

1.8 侵襲小室技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞浸潤能力變化

取出預(yù)冷的Transwell小室(直徑8 μm)放入24孔板中,迅速于侵襲小室底部均勻鋪膠50 μl(基質(zhì)膠需4 ℃融化),后將小室37 ℃培養(yǎng)箱隔夜放置使膠凝化;在小室下層24孔板中加入700 ml含血清的培養(yǎng)基,上層加入200 μl體系中含1×105轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞(將每組細(xì)胞做6個復(fù)孔),將24孔板放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)36 h后,取出小室,棉簽輕輕擦拭小室上層細(xì)胞,PBS清洗2次而后用4%多聚甲醛固定小室下層的細(xì)胞。使用3%結(jié)晶紫溶液染色10 min。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照記錄。在20倍物鏡下對每個復(fù)孔拍1張照片(每個復(fù)孔至少選5個視野),計數(shù)取平均值。實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 絨毛組織RNA質(zhì)量檢測

兩組絨毛組織RNA經(jīng)過質(zhì)檢,紫外分光光度計讀取OD260/OD280比值,比值在1.8～2.0說明RNA未受污染。電泳檢測胎盤組織總RNA質(zhì)量,兩組總RNA在28S、18S以及5S條帶清晰、完整清晰(見圖1),說明RNA未降解,可用于后續(xù)實驗。

圖1 絨毛組織總RNA質(zhì)量瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis results of total RNA of chorionic villus

2.2 絨毛組織中miR-30a-3p表達(dá)水平

結(jié)果顯示,miR-30a-3p在正常組和RSA組的絨毛組織中均有表達(dá),miR-30a-3p在RSA組明顯低于正常組中絨毛組織中的表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(1.3±0.1vs2.4±0.2,P<0.05,見圖2)。

2.3 miR-30a-3p轉(zhuǎn)染效率

向HTR-8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-30a-3p mimic及inhibitor后6 h,熒光顯微鏡下觀察由FAM酶標(biāo)記的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約90%(見圖3),可用于后續(xù)試驗。

與正常組比較,*P<0.05圖2 兩組絨毛組織中miR-30a-3p相對表達(dá)Figure 2 Comparison of miR-30a-3p expression between normal tissue and RSA chorionic villus tissues

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光效率 (×200)Figure 3 Cell fluorescence efficiency after transfection (×200)

2.4 轉(zhuǎn)染后各組miR-30a-3p的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與NC組相比,mimic組中miR-30a-3p的表達(dá)水平顯著增高,inhibitor組中miR-30a-3p表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與NC組比較,*P<0.05圖4 miR-30a-3p在HTR-8細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 4 Expression of miR-30a-3p in HTR-8 cells in each group

2.5 轉(zhuǎn)染miR-30a-3p inhibitor后滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,與NC組相比,inhibitor組滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡率上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

2.6 miR-30a-3p對于滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響

侵襲小室檢測結(jié)果顯示,與NC組相比,inhibitor組細(xì)胞浸潤能力有所下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖6)。

圖5 miR-30a-3p對HTR-8細(xì)胞凋亡能力的影響Figure 5 Effect of miR-30a-3p on apoptosis of HTR-8 cells

圖6 miR-30a-3p對HTR-8細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 6 Effect of miR-30a-3p on invasive ability of HTR-8 cells

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜,近年來越來越多的研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙可能會導(dǎo)致妊娠失敗[6-8]。正常妊娠是極其復(fù)雜且精細(xì)的過程,在此過程中滋養(yǎng)細(xì)胞通過侵襲母體子宮內(nèi)膜并且參與子宮螺旋動脈重塑,從而建立起功能性的母胎界面。然而滋養(yǎng)細(xì)胞功能異?？赡軐?dǎo)致流產(chǎn)、子癇前期、胎兒發(fā)育受限等疾病[9]。近年來有研究證實[10]滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與凋亡失衡是可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病因素之一。

microRNAs(miRNAs)是一類長度約22nt的非編碼小分子RNA,目前發(fā)現(xiàn)miRNA控制超人類1/3的基因,因此與多種疾病相關(guān)[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)絨毛組織存在多種miRNA。這些miRNA能夠參與調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、侵襲、遷移以及血管生成[12,13]。胡建剛等[14]利用基因芯片篩查不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)絨毛組織中存在高表達(dá)的miR-30a,miR-30a家族包括miR-30a-3p及miR-30a-5p兩個成熟亞型。已有研究證實,RSA患者絨毛組織中miR-30a-5p病理性高表達(dá)[15]。本研究我們通過實時定量PCR驗證復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及正常絨毛組織中miR-30a-3p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,相較正常絨毛組織,RSA組中miR-30a-3p表達(dá)顯著降低。證實miR-30a-3p與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)。

miR-30a定位于6號q13中,是miR-30家族成員之一。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-30a在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào),參與了包括肺癌、食管癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16-19]。本研究采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)在HTR-8細(xì)胞中沉默miR-30a-3p,旨在探討miR-30a-3p對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響。實驗結(jié)果顯示:在HTR-8細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-30a-3p inhibitor后,HTR-8細(xì)胞中的表達(dá)量與對照組相比明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯上升,且細(xì)胞的侵襲能力與對照組相比顯著下降,表明miR-30a-3p低表達(dá)可以增加滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,從而降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。因此我們推測,miR-30a-3p可能通過增加滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,從而降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能進(jìn)而參與了RSA的發(fā)病。

孕早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲母體子宮內(nèi)膜的生物學(xué)行為類似于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程,而絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblast, EVT)侵襲功能正常是保證子宮螺旋動脈的重塑和妊娠得以順利進(jìn)行的重要基礎(chǔ)[20]。在此過程中,EVT侵襲是節(jié)制、有序的,且受到一系列分子的調(diào)控。而妊娠早期EVT侵襲能力下降致胎盤發(fā)育異常,是RSA發(fā)生的重要原因。EVT的侵襲功能與細(xì)胞凋亡水平及基質(zhì)金屬蛋白酶活性相關(guān),有學(xué)者發(fā)現(xiàn)RSA患者絨毛組織中金屬基質(zhì)蛋白酶類(matrix metalloproteinase,MMPs)表達(dá)水平顯著降低,且細(xì)胞的凋亡率顯著增加[21,22]。本研究同樣證實了在自然流產(chǎn)的患者低表達(dá)的miR-30a-3p使滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡率明顯增加,浸潤能力下降。這可能是由于滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡增加使得細(xì)胞侵襲能力的下降,進(jìn)而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的MMPs表達(dá)失衡從而導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上,與正常孕婦相比,RSA患者絨毛組織中miR-30a-3p的表達(dá)明顯降低,且體外實驗結(jié)果表明沉默miR-30a-3p能夠增加滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8的凋亡率,并且顯著降低細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。miR-30a-3p凋亡增加后可能通過調(diào)控MMPs/TIMPs通路降低了滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力,導(dǎo)致“胎盤淺著床”。未來我們將繼續(xù)深入研究RSA中miR-30a-3p上下游調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的分子,為闡釋不明原因RSA提供新的思路。