郭 睿,趙世平,張 娜,楊 軍

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:yangjundr@163.com)

胸腹水是惡性腫瘤進(jìn)展、復(fù)發(fā)的常見(jiàn)體征之一,也是判定腫瘤分期和是否進(jìn)展的重要參數(shù)。但是,由于胸腹水涂片、液基制片等常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)檢查實(shí)際的陽(yáng)性檢出率并不高,細(xì)胞蠟塊技術(shù)又耗時(shí)耗力。從而導(dǎo)致腫瘤患者難以得到及時(shí)診斷和治療。因此,探索新的床旁診斷技術(shù)(point-of-care-testing,POCT)實(shí)現(xiàn)對(duì)胸腹水的快速檢測(cè)具有重要的臨床意義[1,2]。

腫瘤細(xì)胞異?；钴S的有氧糖酵解(也稱Warburg效應(yīng))、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)和高代謝狀態(tài)及由此造成的活性氧(reactive oxygen species, ROS)和細(xì)胞游離亞鐵原卟啉(cell free ferrous protoporphyrin, FH)的異常聚集不僅是惡性腫瘤細(xì)胞典型的代謝特征,也直接參與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[3-9]。因而,聯(lián)合檢測(cè)腫瘤細(xì)胞或組織中的ROS和FH的含量,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的早期診斷。目前,ROS+FH聯(lián)合檢測(cè)已被用于多種惡性腫瘤的早期篩查和診斷[10-12]。但是,并未見(jiàn)將ROS和FH聯(lián)合檢測(cè)用于胸腹水樣本診斷的報(bào)道。本研究擬通過(guò)對(duì)胸腹水樣本中ROS和FH進(jìn)行檢測(cè),評(píng)估床旁檢測(cè)ROS+FH在鑒別良惡性胸腹水樣本中的臨床價(jià)值和意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科2021年1月2021年10月胸腹水樣本196例,其中,臨床診斷惡性腫瘤患者(包括初次確診和治療后復(fù)發(fā)患者)樣本108例(其中肺癌患者71例,其他惡性腫瘤患者37例),非惡性腫瘤患者樣本88例(其中炎癥患者62例,其他原因患者26例)。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

上皮細(xì)胞ROS+FH染色試劑盒由深圳海柔思生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞蠟塊制備 所有胸腹水樣本在制作傳統(tǒng)細(xì)胞涂片(conventional cytological smear, CS)的同時(shí),均制備成細(xì)胞蠟塊(cell block,CB),并經(jīng)石蠟切片、HE染色后,由有資質(zhì)的病理醫(yī)師閱片進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)診斷,判定胸腹水的良惡性。必要時(shí),依據(jù)HE鏡下形態(tài)選擇合適抗體進(jìn)行免疫組化染色進(jìn)行輔助診斷。

1.3.2 細(xì)胞學(xué)診斷 所有胸腹水樣本的診斷標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)細(xì)胞涂片、HE染色和細(xì)胞蠟塊、石蠟切片HE染色后,由具有資質(zhì)的病理醫(yī)師進(jìn)行初步診斷。并根據(jù)不同樣本石蠟蠟塊的HE切片中細(xì)胞的鏡下形態(tài),選擇適宜的抗體進(jìn)行免疫組化染色。再由具有資質(zhì)的病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)診,確定最終病理診斷。發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞者歸為惡性組,未見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞者歸為良性組。

1.3.3 ROS+FH染色 取離心富集的胸腹水細(xì)胞混懸液1 ml置于細(xì)胞保存液中,嚴(yán)格按照ROS+FH染色試劑盒的操作步驟說(shuō)明進(jìn)行。3 min內(nèi),ROS試劑管反應(yīng)后呈紅色、紅紫色或紫色判讀為陽(yáng)性(+),FH試劑管反應(yīng)后呈藍(lán)色、墨綠色、綠色判讀為陽(yáng)性(+),ROS和FH均為陽(yáng)性者判讀為陽(yáng)性(+)。均陽(yáng)性顯示該樣本瓦博格效應(yīng)陽(yáng)性,預(yù)示該樣本存在惡性風(fēng)險(xiǎn);均陰性顯示該樣本瓦博格效應(yīng)陰性,預(yù)示尚無(wú)惡性風(fēng)險(xiǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用列聯(lián)表、Fisher精確概率法及SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病理學(xué)診斷結(jié)果

經(jīng)細(xì)胞蠟塊和常規(guī)細(xì)胞涂片細(xì)胞病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),在196例胸腹水樣本中,檢出惡性腫瘤細(xì)胞者67例(記為惡性),未檢出惡性腫瘤細(xì)胞者129例(記為良性)。

2.2 ROS和FH聯(lián)合染色結(jié)果

ROS和FH聯(lián)合染色發(fā)現(xiàn)在196例胸腹水樣本中,ROS陽(yáng)性者82例,FH陽(yáng)性者171例,ROS+FH雙陽(yáng)性者82例(見(jiàn)表1)。其中,以ROS、FH和ROS+FH鑒別診斷胸腹水良惡性的陰性預(yù)測(cè)值卻分別高達(dá)71.05%,72.00%,69.57%(見(jiàn)表2)。

表1 ROS和FH聯(lián)合檢測(cè)鑒別良惡性胸腹水結(jié)果 (例)

表2 采用床旁檢測(cè)ROS和FH鑒別良惡性胸腹水的臨床價(jià)值 (%)

3 討論

胸腹水是進(jìn)展期惡性腫瘤最常見(jiàn)體征之一,也是判斷臨床分期和病情進(jìn)展的重要參數(shù)。但是,由于胸腹水涂片、液基制片等常規(guī)細(xì)胞病理學(xué)檢查流程繁瑣、耗時(shí)耗力,實(shí)際的陽(yáng)性檢出率并不高,常因腫瘤細(xì)胞數(shù)量有限而漏診或無(wú)法診斷,而且,還必須由具有資質(zhì)的病理醫(yī)生才能診斷;雖然細(xì)胞蠟塊技術(shù)能顯著提高胸腹水樣本確診率,但制作流程更復(fù)雜、耗時(shí)更長(zhǎng),而且,也同樣必須要由具有資質(zhì)的病理醫(yī)生才能診斷[13,14];細(xì)胞DNA定量技術(shù)則須依賴特殊試劑、專用設(shè)備和分析軟件[15]。因此,探索能實(shí)現(xiàn)對(duì)胸腹水樣本快速檢測(cè)和定性診斷的床旁診斷(point-of-care-testing,POCT)新方法具有重要的臨床意義。

活性氧是一組含有氧自由基的高活性化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱,是細(xì)胞生物氧化還原過(guò)程中自然產(chǎn)生的正常產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn),癌基因突變、抑癌基因失活、轉(zhuǎn)錄因子活化、線粒體損傷、非特異性的慢性炎癥、腫瘤細(xì)胞的高代謝狀態(tài)及放化療和生物免疫治療等等因素均可直接或間接引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS的聚集,并由此導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞氧化還原態(tài)的失衡,而處于一個(gè)強(qiáng)氧化應(yīng)激、低抗氧化的狀態(tài)。而且,ROS常以濃度依賴性方式引起不同程度的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化和損傷,從而發(fā)揮雙重生物學(xué)效應(yīng)[16]:急性高濃度ROS可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死;中濃度ROS可引起細(xì)胞周期暫時(shí)性或永久性阻滯,誘導(dǎo)細(xì)胞分化;慢性低濃度ROS則可造成非致死性蛋白質(zhì)、線粒體和細(xì)胞膜損傷功能異常,誘導(dǎo)核DNA(nDNA)交聯(lián)及堿基突變或單/雙鏈斷裂和線粒體DNA(mt-DNA)突變、基因組不穩(wěn)定性,促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT),而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移[17,18]。

異常活躍的有氧糖酵解和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)是惡性腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝的主要方式,也是與腫瘤細(xì)胞內(nèi)高ROS引起的氧化還原失衡相伴隨的另一種典型的代謝特征[19-21]。有氧糖酵解產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate, G6P)可作為PPP途徑底物,在葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PD)的作用下生成5-磷酸核糖和NADPH[22,23]。而NADPH則可直接參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持,將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH),而谷胱甘肽過(guò)氧化物酶則以GSH為供氫體,分解H2O2減低ROS濃度,并生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)[24]。而這一過(guò)程造成的腫瘤細(xì)胞的低氧環(huán)境可引起低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1a,HIF-1a)的磷酸化,并通過(guò)活性氧族(ROS)激活下游激酶系統(tǒng),產(chǎn)生一種親脂性分子(hydrophilic fatty molecules,HF),HF進(jìn)入血紅素結(jié)合蛋白(HP蛋白)的疏水核內(nèi),改變蛋白質(zhì)α鏈CD3His和β鏈CD3Ser、E10Lys的極性,使位于疏水核中的亞鐵原卟啉脫落,成為細(xì)胞游離亞鐵原卟啉[25]。

由此可見(jiàn),ROS和FH含量增高不僅是腫瘤發(fā)生的極早期代謝事件,也是惡性腫瘤典型的代謝特征,且FH含量與惡性腫瘤細(xì)胞的異常糖代謝間存在因果性關(guān)系。同時(shí),ROS和FH含量只與腫瘤細(xì)胞的高代謝狀態(tài)相關(guān),而與腫瘤的組織學(xué)類型無(wú)關(guān)。因而,ROS和FH可作為惡性腫瘤特異的廣譜代謝性分子標(biāo)志物,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS+FH的含量,即可判斷細(xì)胞代謝功能狀態(tài),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)惡性腫瘤的篩查、極早期診斷、隨訪及病情監(jiān)測(cè)[26,27]。

由于ROS和FH具有較高的反應(yīng)活性,可與相應(yīng)的化學(xué)試劑反應(yīng)生成有色物質(zhì)而進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。其中,比色法具有成本低、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備,數(shù)分鐘內(nèi)采用肉眼觀察反應(yīng)液顏色即可判定結(jié)果,且對(duì)判讀人員無(wú)資質(zhì)要求,具有典型的床旁檢測(cè)(POCT)技術(shù)特征。尤其適用于惡性腫瘤的床旁檢測(cè)和篩查。目前,ROS+FH聯(lián)合檢測(cè)已被用于子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、直腸癌、鼻咽癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的普查、極早期診斷、隨訪及病程監(jiān)測(cè),并顯示出明顯的臨床價(jià)值。

該研究通過(guò)在196例胸腹水樣本評(píng)估ROS和FH聯(lián)合檢測(cè)在胸腹水定性診斷中的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以ROS為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標(biāo)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確率分別50.75%,62.79%,41.46%和58.67%;以FH為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標(biāo)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確率分別89.55%,13.95%,35.09%和39.80%;以ROS+FH聯(lián)合檢測(cè)為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標(biāo)的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確率分別為89.55%,12.40%,34.68%和38.78%(見(jiàn)表2)。由此可見(jiàn),分別以ROS、FH和ROS+FH聯(lián)合為鑒別胸腹水良惡性的診斷指標(biāo)的敏感性、特異性、準(zhǔn)確率并不盡如人意。顯然,這與ROS和FH的產(chǎn)生不僅與癌細(xì)胞特異性代謝有關(guān),也與感染、炎癥等因素密切相關(guān)。因而,ROS+FH聯(lián)合染色并不能用于胸腹水樣本良惡性的有效診斷。

盡管如此,該研究結(jié)果還顯示,ROS、FH和ROS+FH作為診斷指標(biāo)的陰性預(yù)測(cè)值卻分別高達(dá)71.05%,72.00%,69.57%。這說(shuō)明,ROS和FH聯(lián)合染色雖不能用于胸腹水樣本良惡性的有效診斷,但仍可憑借其較高的陰性預(yù)測(cè)值而用于排除胸腹水的惡性風(fēng)險(xiǎn)。

而且,相較于傳統(tǒng)細(xì)胞病理學(xué)檢查、細(xì)胞蠟塊和細(xì)胞DNA定量等技術(shù),ROS和FH聯(lián)合檢測(cè)依賴其顯著的床旁檢測(cè)特征,可有效用于胸腹水樣本的排陰性篩查,從而快速實(shí)現(xiàn)對(duì)胸腹水患者的分層管理。ROS+FH陽(yáng)性樣本具有惡性風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)進(jìn)一步制作細(xì)胞蠟塊以明確胸腹水的性質(zhì);ROS+FH陰性樣本惡性風(fēng)險(xiǎn)不大,可免于制作細(xì)胞蠟塊等復(fù)雜的細(xì)胞病理學(xué)檢查。從而有效節(jié)約患者費(fèi)用和醫(yī)療資源。

總之,盡管ROS+FH染色并不能用于診斷胸腹水的良惡性,但可有效用于胸腹水樣本的排陰性篩查,從而快速排除良性腫瘤患者樣本,實(shí)現(xiàn)對(duì)胸腹水患者的分層管理,有效節(jié)約患者費(fèi)用和醫(yī)療資源。