王邦義,李 璐,李更田,鄭慧銘

(1上海潤家司法鑒定中心,上海 200072;2上海市公安局靜安分局刑事科學技術(shù)研究所)

短串聯(lián)重復序列(short tandem repeats, STR)廣泛存在于人類基因組中,核心序列一般由2～6個堿基構(gòu)成,其核心序列串聯(lián)重復排列的數(shù)目變化構(gòu)成序列長度差異,具有高度多態(tài)性。短串聯(lián)重復序列作為一種遺傳標記能在群體中穩(wěn)定遺傳,且遺傳遵循孟德爾遺傳定律。隨著DNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展,近年來多種由STR遺傳標記組成系統(tǒng)的商品化試劑盒獲得認可,STR自動分型技術(shù)得以普及。因其具有高度多態(tài)性、穩(wěn)定的遺傳性和可重復性、自動化程度高、鑒別能力強等特點被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)物證學領(lǐng)域[1,2]。

TPOX(thyroid peroxidase)基因座發(fā)現(xiàn)于人類甲狀腺過氧化物酶基因的第10個內(nèi)含子,位于人類2號染色體短臂近末端,核心重復單位AATG,是一個多態(tài)性適中、突變率低能穩(wěn)定遺傳的基因座[3](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M68651.1/)。

關(guān)于在TPOX基因座檢測時,同一個個體可以檢出3個基因的現(xiàn)象于1999年由Crouse等[4]首先發(fā)現(xiàn)并報道,STRbase數(shù)據(jù)庫也列出TPOX發(fā)生三等位基因的頻率較高。本研究基于2例TPOX位點存在三等位基因的案例,特針對此問題進行分析討論,并提供類似問題的參考解決方案。

1 案例

1.1 來源

案例來源于我中心申請親子鑒定的被鑒定人的末梢血,其中案例1為父、母、子三人的三聯(lián)體鑒定,案例2為父、子二人的二聯(lián)體鑒定,所報道結(jié)果均已征得委托人同意。

1.2 檢測方法

上述5份樣本采用Chelex-100快速提取法各自分別進行基因組DNA抽提;以提取的DNA為模板,用試劑盒GoldeneyeTM20A DNA身份鑒定系統(tǒng)[基點認知技術(shù)(北京)有限公司]分別進行PCR擴增(設(shè)立對照組,陰性對照組模板為去離子水,陽性對照組模板為9947A);再用試劑盒PowerPlex?21 system(美國Promega公司)分別進行PCR擴增(設(shè)立對照組,陰性對照組模板為去離子水,陽性對照組模板為2800M);擴增產(chǎn)物用3130XL型遺傳分析儀(Applied Biosystems,ABI)進行毛細管電泳和數(shù)據(jù)收集,用GeneMapper ID-X 1.4軟件分析數(shù)據(jù)并生成分型圖譜。

1.3 檢測結(jié)果

使用GoldeneyeTM20A試劑盒檢測結(jié)果中,陰性對照結(jié)果無分型,陽性對照9947A分型準確,所有檢測樣本除TPOX基因座外,其他位點分型均正常,為排除實驗污染或電泳異常信號等其他外界因素影響,用GoldeneyeTM20A試劑盒重復上述實驗所得結(jié)果一致,檢測樣本的分型結(jié)果見表1。為防止試劑盒非特異性擴增影響,用PowerPlex?21試劑盒進行驗證,陰性對照結(jié)果無分型,陽性對照2800M分型準確,所有樣本分型結(jié)果與GoldeneyeTM20A試劑盒在相同基因座上分型結(jié)果一致。

案例1 TPOX基因座分型:母親的等位基因為8/11/12,孩子的等位基因為9/11/12,父親的等位基因為8/9(見圖1)。案例2 TPOX基因座分型:父親的等位基因為8/11/12,孩子的等位基因為9/11/12(見圖2)。

由上述結(jié)果仍可看出TPOX基因座上等位基因雖然數(shù)量異常,但是子代的等位基因依然可從親代基因型中找到來源。

表1 兩案例GoldeneyeTM 20A試劑盒檢測分型結(jié)果

圖1 案例1 GoldeneyeTM 20A試劑盒檢測TPOX基因座分型圖

圖2 案例2 GoldeneyeTM 20A試劑盒檢測TPOX基因座分型圖

2 討論

在用軟件分析STR分型時發(fā)現(xiàn)此2個案例均出現(xiàn)了TPOX三等位基因現(xiàn)象,峰高比值接近1 ∶1 ∶1。根據(jù)上述檢驗結(jié)果分析,以上2例案件TPOX基因座確為3個等位基因,由于在GoldeneyeTM20A或PowerPlex?21檢測系統(tǒng)中,基因座D2S1338也是位于2號染色體上,但其分型未出現(xiàn)超過2個以上等位基因或者峰高比異常的2個等位基因,以上分析表明并非染色體數(shù)量異常導致結(jié)果,所以該種情況應(yīng)注意與三體綜合征出現(xiàn)三等位基因的現(xiàn)象加以區(qū)別[5]。

目前也有較多文章報道過類似現(xiàn)象[6-8],以上案例及本案件中出現(xiàn)的3個等位基因從測序結(jié)果分析都是真正的TPOX基因[9],只是由于染色體序列結(jié)構(gòu)異常導致其中一條2號染色體有兩個包含了TPOX基因座的區(qū)域。目前這種特殊序列結(jié)構(gòu)已被報道的整合方式是2號染色體序列在1201551～1201552 bp之間插入了三部分序列段,分別為chr2:1201552～1257216 bp序列段、長度52 bp的連接序列段和反向排序的chr2:1377990～1516026 bp序列段[10],其中反向排序的chr2:1377990～1516026 bp序列段包含了TPO基因外顯子1～14段的全部區(qū)域[11],而TPOX基因座便位于其中,故該染色體呈現(xiàn)了2個真實的TPOX基因。當然研究中也有案例并未按照此整合方式排序,但是推測原理相近,都是包含了2個TPOX基因座所在區(qū)域。

這種序列結(jié)構(gòu)異常現(xiàn)象產(chǎn)生機制尚無明確報道,周單華等[12]文中提及國內(nèi)外較為認同的幾種出現(xiàn)3個等位基因可能的觀點中,同源染色體在減數(shù)分裂過程中基因重組時不等價交換所致更符合本次的2個案例現(xiàn)象。

由上述2個案例可以看出這種序列結(jié)構(gòu)異常的2號染色體依然可以“綁定”遺傳給子代,如此分析依然符合孟德爾遺傳定律。根據(jù)GB/T 37223-2018《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》的要求:

(1)案例1的TPOX基因座親權(quán)指數(shù)計算:母親8/11/12,孩子9/11/12,父親8/9,PI=X/Y;X=母親同時提供等位基因11&12的概率×父親提供等位基因9的概率=0.5×0.5,Y=母親同時提供等位基因11&12的概率×隨機男子提供等位基因9的概率=0.5×P9,三聯(lián)體PI=1/2P9;

(2)案例2的TPOX基因座親權(quán)指數(shù)計算:父親為8/11/12,孩子為9/11/12,此項親權(quán)指數(shù)分析僅考慮在母親TPOX基因座為正常分型的情況,PI=X/Y;X=母親提供等位基因9的概率×父親同時提供等位基因11&12的概率=P9×0.5,Y=母親提供等位基因9的概率×隨機男子同時提供等位基因11&12的概率=P9×P11&12,二聯(lián)體PI=1/2P11&12。

不難看出,不論二聯(lián)體或三聯(lián)體,這種異常的雙等位基因來源于母親,親(父)權(quán)指數(shù)并不會受影響。如果來源于父親則親(父)權(quán)指數(shù)計算都會涉及人群中隨機男子同時提供已存在的雙等位基因的概率問題,目前尚無官方數(shù)據(jù)統(tǒng)計該種綁定現(xiàn)象出現(xiàn)的概率。常用的處理方法有3種:①將這種異常結(jié)構(gòu)的基因座看作整體,以出現(xiàn)稀有等位基因的方式處理,即出現(xiàn)的基因頻率為以該基因座最小基因頻率計算[13];②出現(xiàn)的基因頻率以案件中出現(xiàn)的雙等位基因頻率的乘積計算[14];③據(jù)Yang等[11]在報道中提到TPOX基因座三等位基因在中國漢族人群中出現(xiàn)的頻率約為0.018 9%,可以參考此數(shù)值作為該現(xiàn)象的基因頻率。

本文中列舉的TPOX在一條染色體上有2個區(qū)域的現(xiàn)象也可能還有別的表現(xiàn)形式,如TPOX基因座上有2個等位基因峰,峰高比例接近2:1,甚至僅1個等位基因峰存在也有可能具備該現(xiàn)象(這種情況容易被當做正常結(jié)果忽略),且在其他基因座上也會有類似情況出現(xiàn)[15],在實際案例中注意根據(jù)具體情況分析辨別。本文意在現(xiàn)有標準或規(guī)范短缺的情況下,對出現(xiàn)這種特殊三帶型基因座分析及PI值計算提供借鑒和參考。