高文婷,姜雪霞,譚 清,劉希沖,李明虹,李星道,郭戍辰,白劍英

(山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:jybai66@aliyun.com)

甲醛(formaldehyde,FA)是一種無色、有強(qiáng)烈刺激性氣味的醛類化合物,易溶于水及多種有機(jī)溶劑。甲醛性質(zhì)不穩(wěn)定,可通過與蛋白質(zhì)、核酸和不飽和脂肪酸等生物大分子結(jié)合產(chǎn)生毒性作用[1]。甲醛廣泛應(yīng)用于建筑絕緣材料、木材、膠合板[2],因此是室內(nèi)常見污染物。此外由日漸發(fā)達(dá)的交通運(yùn)輸引發(fā)的光化學(xué)煙霧中也有一定的甲醛生成。這些均導(dǎo)致人群經(jīng)呼吸道的甲醛暴露非常普遍。某些食品中甲醛的違規(guī)添加還可導(dǎo)致人群的消化道接觸。甲醛進(jìn)入機(jī)體后需在肝臟進(jìn)行代謝解毒。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明低濃度短時(shí)間的甲醛單獨(dú)暴露對ICR小鼠具有肝臟毒性[3]。體外實(shí)驗(yàn)研究顯示甲醛暴露會干擾肝細(xì)胞甘油三酯和膽固醇代謝平衡[4,5]。甘油三酯性質(zhì)穩(wěn)定,不會直接對肝細(xì)胞造成損傷,而膽固醇有直接的肝細(xì)胞毒性[6]。肝臟是體內(nèi)膽固醇代謝的主要場所,在肝臟內(nèi)膽固醇可轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外,肝臟也可直接將膽固醇排入腸內(nèi)隨腸道排出體外。據(jù)報(bào)道甲醛可使肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成增加,使肝細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇含量增加[5]。異常的膽固醇水平可對肝細(xì)胞造成直接損傷。甲醛染毒后肝細(xì)胞內(nèi)增加的膽固醇是會排出細(xì)胞,還是以膽固醇的形式積聚在細(xì)胞內(nèi)。甲醛造成肝臟損傷的機(jī)制仍然不清楚,是否可以猜想甲醛通過影響肝細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇的排出而造成肝損傷。本實(shí)驗(yàn)通過觀察甲醛染毒后HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因表達(dá)水平的變化,了解甲醛是否會影響肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排,探討甲醛引起肝臟損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株HepG2,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所干細(xì)胞庫。

1.2 主要儀器

Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司),Model 680型酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司),UV-2450型紫外分光光度儀(上海納锘儀器有限公司),line gene 9600型熒光定量PCR儀(杭州BIOER科技有限公司),HFsafe-1200型生物安全柜(Heal Force公司)。

1.3 主要試劑

甲醛染毒液的配制:9.5 μl甲醛原液加入到10 ml培養(yǎng)基中,得到濃度為12.5 mmol/L的甲醛溶液,按梯度稀釋的方法配制所需濃度的染毒液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞接種于DMEM完全培養(yǎng)基中,并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測甲醛染毒HepG2細(xì)胞的活性

分別以濃度0.02,0.10,0.50 mmol/L FA溶液為處理劑,陰性對照為完全培養(yǎng)基,陽性對照組為0.50 μg/ml布雷德菌素A(Brefeldin A,BFA)以及1 mmol/L油酸(oleic acid,OA)處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h。染毒結(jié)束后,吸去培養(yǎng)基,加入10 μl MTT染液及90 μl新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去培養(yǎng)基,加入100 μl二甲基亞砜溶解液,搖床振蕩10 min,在酶標(biāo)儀490 nm處測量各孔的吸光度值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.6 HepG2細(xì)胞膽固醇外排相關(guān)基因表達(dá)的檢測

分別以濃度0.05,0.10,0.20 mmol/L FA為處理劑,陰性對照為完全培養(yǎng)基,陽性對照組為0.50 μg/ml BFA以及1 mmol/L OA處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h。采用qRT-PCR法測定肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因三磷酸腺苷結(jié)合盒A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)、三磷酸腺苷結(jié)合盒G5(ATP-binding cassette transporter G5,ABCG5)、三磷酸腺苷結(jié)合盒G8(ATP-binding cassette transporter G8,ABCG8)mRNA的表達(dá)水平。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用UV-2450紫外分光光度儀檢測RNA的純度。用兩步反轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行cDNA的合成?；蛞镄蛄幸姳?,β-actin為內(nèi)參。兩步法PCR擴(kuò)增程序,第一步,預(yù)變性,95 ℃,30 s循環(huán)1次。第二步,變性95 ℃,10 s,退火延伸60 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 膽固醇外排相關(guān)基因序列

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測甲醛染毒HepG2細(xì)胞的活性

與陰性對照相比,0.02 mmol/L FA和0.10 mmol/L FA染毒24,48 h未觀察到細(xì)胞活性的明顯降低(P>0.05);0.50 mmol/L FA染毒24,48 h均可明顯降低HepG2細(xì)胞活性(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均可降低HepG2細(xì)胞活性(P<0.05);1.00 mmol/L OA對HepG2細(xì)胞活性未產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05,見表2)。

表2 不同濃度FA對HepG2細(xì)胞活性的影響

2.2 FA對HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因ABCA1和ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響

FA染毒HepG2細(xì)胞24,48 h,膽固醇外排相關(guān)基因ABCA1 mRNA、ABCG1 mRNA表達(dá)水平結(jié)果見表3。與陰性對照相比,0.20 mmol/L FA染毒24,48 h均使ABCA1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCA1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

與陰性對照相比,0.05,0.10,0.20 mmol/L FA染毒24 h均使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.20 mmol/L FA染毒48 h使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);1.00 mmol/L OA染毒48 h使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

表3 FA對HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)水平的影響

2.3 FA對HepG2內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)水平的影響

FA染毒HepG2細(xì)胞24,48 h,膽固醇外排相關(guān)基因ABCG5 mRNA、ABCG8 mRNA的表達(dá)水平結(jié)果見表4。與陰性對照相比,0.20 mmol/L FA染毒24,48 h均使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);1.00 mmol/L OA染毒48 h使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

與陰性對照相比,0.20 mmol/L FA染毒24 h可使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.10,0.20 mmol/L FA染毒48 h均使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);0.50 μg/ml BFA染毒24,48 h均使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。

表4 甲醛對HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

甲醛是一種廣泛存在的環(huán)境污染物,具有刺激作用、致畸作用、致敏作用,與白血病、鼻咽癌的發(fā)生密切相關(guān),被世界衛(wèi)生組織列為Ⅰ類致癌物[7]。膽固醇是細(xì)胞膜的重要組成部分,脊椎動(dòng)物的所有真核細(xì)胞都可以合成膽固醇。為了維持膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài),細(xì)胞通過重新合成或攝取脂蛋白而獲得的膽固醇量必須與通過降解或排泄而損失的膽固醇量相平衡。膽固醇通過ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette transporter,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞中排出,分別是ABCG5/ABCG8和ABCA1/ABCG1[8]。ABCG5、ABCG8和ABCA1、ABCG1這4種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在肝細(xì)胞、腸細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有表達(dá),可以調(diào)控膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。肝臟是體內(nèi)膽固醇代謝的主要場所,膽固醇代謝紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),如非酒精性脂肪性肝炎[9]。HepG2細(xì)胞源于人肝臟胚胎瘤細(xì)胞,它保留了正常肝細(xì)胞的許多生物學(xué)特性,擁有較完整的代謝酶系[10],所以我們以HepG2細(xì)胞為模型,采用不同濃度的FA對其進(jìn)行染毒,觀察FA是否影響肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)水平。

細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn),甲醛對HepG2細(xì)胞活性存在抑制作用,隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞活性呈逐漸降低趨勢。0.50 mmol/L的甲醛對HepG2細(xì)胞具有直接的損傷效應(yīng),可引起細(xì)胞活性降低50%以上。由于高劑量組損傷作用過大,在接下來的甲醛慢性毒性作用的機(jī)制研究中,采用了較低的染毒劑量(0.05,0.10,0.20 mmol/L),即將高劑量組調(diào)整為0.20 mmol/L,該劑量約為我國現(xiàn)行生活飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中甲醛濃度的10倍[11]。

ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。ABCA1/ABCG1、ABCG5/ABCG8作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員,均包含標(biāo)志性ATP結(jié)合域,以ATP作為能量供應(yīng)體對各種物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),是膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)控靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄激活因子肝X受體α(LXRα)可通過激活A(yù)BC超家族中ABCA1/G1和ABCG5/G8等的表達(dá)調(diào)節(jié)糖脂代謝和維持膽固醇穩(wěn)態(tài),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇的排出[12]。降脂藥可通過使小鼠肝臟中的ABCA1/ABCG1的基因和蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)肝細(xì)胞中膽固醇的排出,從而緩解高脂血癥小鼠的肝臟中膽固醇等脂質(zhì)沉積[13]。邵波等[11]報(bào)道蛹蟲草的主要活性成分蛹蟲草多糖通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)-LXRα-ABCA1/ABCG1通路,促進(jìn)了體內(nèi)過量膽固醇經(jīng)肝細(xì)胞外排。在本實(shí)驗(yàn)中0.20 mmol/L FA染毒24 h和48 h均使ABCA1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。染毒24 h,0.05,0.10,0.20 mmol/L FA均使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05);染毒48 h,0.20 mmol/L FA使ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)證明,甲醛染毒可使HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCA1/ABCG1 mRNA表達(dá)水平增加,甲醛染毒后不會抑制肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)。

ABCG5/ABCG8異源二聚體是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G家族的兩個(gè)成員,是維持細(xì)胞膽固醇水平所必需的。ABCG5和ABCG8,當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí),是無功能的半轉(zhuǎn)運(yùn)體,它們在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異二聚化形成異二聚體后獲得固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能。肝臟中ABCG5/ABCG8介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇向膽汁的排泄[14]。研究表明在人正常肝細(xì)胞(HL 7702)中過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)過表達(dá)可增加ABCG5/ABCG8的表達(dá),介導(dǎo)肝細(xì)胞中的膽固醇外排,從而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平[15]。ABCG5和ABCG8在小鼠中的過度表達(dá)會使膽汁中的膽固醇水平增加5倍以上,從而降低小鼠肝臟中的膽固醇[16]。在本實(shí)驗(yàn)中,染毒24,48 h,0.20 mmol/L FA均使ABCG5 mRNA表達(dá)水平增加。0.20 mmol/L FA染毒24 h和0.10,0.20 mmol/L FA染毒48 h均使ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加。實(shí)驗(yàn)證明,甲醛染毒可使HepG2細(xì)胞內(nèi)ABCG5/ABCG8 mRNA表達(dá)水平增加,甲醛染毒后不會抑制肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述,高濃度甲醛可明顯抑制HepG2細(xì)胞的活性,對肝細(xì)胞有一定的損傷作用。甲醛未抑制膽固醇外排相關(guān)ABCA1 mRNA、ABCG1 mRNA、ABCG5 mRNA、ABCG8 mRNA的表達(dá),因此膽固醇外排減少不是甲醛引起肝臟損傷的原因?？赡苷羌?xì)胞內(nèi)升高的膽固醇水平誘導(dǎo)了外排相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇外排,以減輕其危害。有關(guān)甲醛引起肝細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇升高,以及甲醛對肝細(xì)胞的慢性損傷作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。