朱世茂,李惠武,楊銀銀,海妮薩依姆·圖爾蓀,王永晨,李 卉

(1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室,烏魯木齊 830011;2粵北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心;3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:huihui922@126.com)

食管癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一,全球食管癌發(fā)病率和死亡率分別位居第7位和第6位[1]。目前食管癌的診斷和治療手段雖有很大改進(jìn),但由于早期食管癌缺乏特異性癥狀,多數(shù)食管癌患者就診時(shí)已經(jīng)處于中晚期,且總體預(yù)后差,5年生存率僅為5%～10%[2]。隨著醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展和深入,免疫療法已成為治療癌癥的一種效策略[3]。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種多效性細(xì)胞因子,在免疫穩(wěn)態(tài)、炎癥和宿主防御中起核心作用。根據(jù)細(xì)胞環(huán)境,它可以誘導(dǎo)多種效應(yīng),如凋亡、壞死、免疫細(xì)胞激活等,在腫瘤免疫監(jiān)測中具有重要意義。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起著重要作用,它表現(xiàn)出促腫瘤和抗腫瘤的雙重效應(yīng)[4]。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)及其受體PD-1是重要免疫檢查點(diǎn)分子,正常情況下下,PD-L1與其受體PD-1結(jié)合后可抑制T細(xì)胞的過度增殖活化,維持機(jī)體正常的免疫平衡[5]。在腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中PD-L1的異常高表達(dá)可介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是抗腫瘤治療的重要熱點(diǎn)[6]?，F(xiàn)有研究表明,TNF-α可在包括脊索瘤在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)升高[7],而在食管癌中的研究卻少有報(bào)道。

因此,鑒于細(xì)胞因子TNF-α在腫瘤中特殊作用,高表達(dá)的PD-L1能夠介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,本文旨在研究TNF-α在食管鱗癌細(xì)胞株Eca109中能否調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá),以及可能的分子調(diào)控機(jī)制,并為食管癌的干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

食管鱗癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞(細(xì)胞株購買于武漢普諾賽生命科技有限公司,本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶細(xì)胞消化液、磷酸緩沖鹽溶液購自以色列Biological Industry公司,磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑購自美國Thermo公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司;兔抗人PD-L1抗體、兔抗人PKA抗體購自美國Abcam公司;兔抗人P-CREB抗體購自美國Cell Signaling Technology公司、TNF-α細(xì)胞誘導(dǎo)因子購自美國peprotech公司;Staurosporine抑制劑購自美國Selleck公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自中國大連TaKaRa公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人食管鱗癌細(xì)胞系Eca109復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清和含青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2條件的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48 h換液一次,待培養(yǎng)細(xì)胞貼壁70%以上時(shí)按實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行細(xì)胞傳代。將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、TNF-α組和TNF-α+Staurosporine組。Staurosporine是一種蛋白酶抑制劑,可抑制PKA。其中TNF-α和Staurosporine這兩種物質(zhì)的工作濃度均為20 ng/ml。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測PD-L1 mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并測定RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,放置于-20 ℃保存。上海生工公司合成所需引物。PD-L1引物如下,F:5′-CCTACTGGCATTTGCTGAACGCAT-3′;R:5′-ACCATAGCTGATCATGCAGCGGTA-3′;以β-actin作為內(nèi)參,F:5′-GAGCACAGAGCCTCGTT-3′;R:5′-GAGCGCGGCGATATCATCA-3′,PCR擴(kuò)增,進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.3 免疫熒光染色檢測PD-L1的蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞,消化成懸液后接種于6孔板內(nèi)的玻璃爬片上,待細(xì)胞貼壁后,用濃度為20 ng/ml的TNF-α誘導(dǎo)24 h,以未做處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。加入磷酸緩沖鹽溶液清洗并棄掉洗液,用4%多聚甲醛室溫固定15 min后用磷酸緩沖鹽溶液清洗3次,每次10 min。兔抗人PD-L1(1 ∶200)室溫、黑色濕盒封閉1 h,然后洗滌3次,每次10 min。使用熒光二抗室溫、黑色濕盒孵育1 h,然后洗滌3次,每次10 min;然后加入Hochest熒光染料進(jìn)行細(xì)胞核染色。最后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集圖片。

1.2.4 Western blot檢測PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取,BCA法進(jìn)行總蛋白濃度的測定。將總蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,單克隆抗體一抗(5% BSA稀釋,稀釋比例1 ∶1 000),4 ℃搖床過夜。然后PBST洗去一抗,孵育二抗(5% BSA稀釋,山羊抗兔1 ∶5 000,山羊抗鼠1 ∶20 000)室溫1 h。洗滌之后用ECL顯影試劑顯色。Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比用單因素方差分析。以P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對(duì)Eca109細(xì)胞PD-L1 mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示,使用TNF-α作用細(xì)胞24 h后,與空白對(duì)照組比較,PD-L1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05,見圖1);與TNF-α組相比,TNF-α+Staurosporine組PD-L1 mRNA水平降低(P<0.05,見圖1)。

2.2 TNF-α對(duì)Eca109細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,TNF-α組使用TNF-α作用細(xì)胞24 h后激光共聚焦鏡下觀察PD-L1(圖中紅色光點(diǎn))的數(shù)量明顯增多(見圖2),PD-L1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,見圖3),Western blot結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致。

2.3 抑制PKA通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,TNF-α組中PD-L1的蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05,見圖4),p-CREB和PKA蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05,見圖4);與TNF-α組比較,在聯(lián)合使用TNF-α和Staurosporine后,TNFα+Staurosporine組中PD-L1、P-CREB和PKA的蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05,見圖4)。

3 討論

食管癌是世界范圍內(nèi)最致命的惡性腫瘤之一。它的兩種主要組織病理學(xué)分型是食管鱗狀細(xì)胞癌和腺癌,這兩種亞型的發(fā)病率因地理區(qū)域而異:食管鱗狀細(xì)胞癌在東亞、東部和南部非洲以及南歐的患病率較高,而腺癌在北美和歐洲地區(qū)更為常見[8],全球范圍內(nèi)的食管鱗狀細(xì)胞癌約占食管癌病例的80%以上[9]。食管癌的發(fā)病原因尚不清楚,通常認(rèn)為與遺傳因素、環(huán)境因素和飲食習(xí)慣等有密切關(guān)系[10],因此,在食管癌中揭示疾病的分子機(jī)制,并為食管癌的干預(yù)治療提供理論依據(jù)尤為重要。

細(xì)胞因子對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有不可逆的改變作用,其中TNF-α主要是由白細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞分泌的一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子[11],其已被證明可以在多種癌細(xì)胞中誘導(dǎo) PD-L1的表達(dá)水平的升高,如卵巢癌、肝癌、胰腺癌等[12-14],且PD-L1的升高與癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)。為了探究TNF-α是否能夠在食管癌細(xì)胞中誘導(dǎo) PD-L1的表達(dá),本研究中利用食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞為研究對(duì)象,通過PCR、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法檢測,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用TNF-α誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞時(shí)可以促進(jìn)PD-L1的表達(dá)升高,表明TNF-α參與PD-L1上調(diào)過程。但是TNF-α調(diào)節(jié)Eca109細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高的途徑需要進(jìn)一步研究。

免疫檢查點(diǎn)阻斷治療是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤免疫治療方法之一。PD-L1及其受體PD-1信號(hào)通路是一個(gè)已經(jīng)被用于多種癌癥臨床治療的免疫檢查點(diǎn)[15]。在多種類型的腫瘤中針對(duì)PD-L1或PD-1的腫瘤免疫治療已被證明是有效的,具有持久、毒性較小的抗腫瘤免疫反應(yīng)[6]。免疫逃逸是腫瘤的一個(gè)標(biāo)志,也是影響腫瘤臨床治療效果的主要原因。腫瘤細(xì)胞可表達(dá)多種免疫抑制信號(hào)蛋白,導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能障礙和凋亡,其中一個(gè)抑制分子是PD-L1[16]。在腫瘤發(fā)生時(shí),PD-L1與PD-1結(jié)合可阻止T細(xì)胞的活化和增殖,負(fù)性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生,當(dāng)阻斷PD-L1/PD-1時(shí)可以重新激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。腫瘤中PD-L1的表達(dá)受不同因素的影響,主要包括信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳調(diào)控,翻譯機(jī)翻譯后修飾調(diào)控等[17]。有研究結(jié)果表明[18]當(dāng)抑制蛋白激酶A(PKA)時(shí),在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)細(xì)胞株中cAMP通過PKA-CREB通路誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)升高的作用被逆轉(zhuǎn)。本研究中Eca109細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)處理后,通過熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果表明,TNF-α聯(lián)合Staurosporine處理Eca109細(xì)胞后可降低PD-L1 mRNA的表達(dá),同時(shí)PD-L1、p-CREB和PKA的蛋白表達(dá)也降低,逆轉(zhuǎn)了TNF-α上調(diào)PD-L1表達(dá)的作用,說明TNF-α促PD-L1的表達(dá)可能與PKA-CREB信號(hào)通路有關(guān),但是具體的調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述,本文研究了細(xì)胞因子TNF-α對(duì)PD-L1表達(dá)的影響以及相關(guān)途徑的探討,發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞PD-L1的表達(dá),而且TNF-α上調(diào)PD-L1表達(dá)作用可能與PKA-CREB信號(hào)通路有關(guān),加深對(duì)TNF-α誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)過程的理解,有助于為探尋食管癌的治療靶點(diǎn)提供理論參考。