馮晨晨 史麗莉 李慧 劉太香 丁文藝 陳青

ABO是目前發(fā)現(xiàn)的43個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中最重要的血型系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)400多個(gè)ABO等位基因，與ABO亞型有關(guān)的基因變異包括錯(cuò)義變異、插入或缺失變異、重組等。分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)證實(shí)ABO亞型具有遺傳異質(zhì)性，同一種表型可以由不同的等位基因或者基因座變異引起。不同變異形式會(huì)影響等位基因的表達(dá)，同時(shí)不同等位基因之間也會(huì)相互影響導(dǎo)致相同變異位點(diǎn)出現(xiàn)不同表型。本研究從一例特殊的ABO亞型鑒定入手，結(jié)合綜述國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究探討在A/B雜合子中變異A等位基因或B等位基因表達(dá)相互增強(qiáng)的現(xiàn)象。

材料與方法

1 研究對(duì)象 患者，女，30歲，孕2產(chǎn)1，無輸血史。本次入院正常產(chǎn)檢。

2 主要試劑與儀器

2.1 血清學(xué)檢測(cè)試劑：抗-A、抗-B血型定型試劑（單克隆抗體）（批號(hào)20200710，克隆號(hào)SRBCB3+9113D10和SRBC-C1+9621A8）、人ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑盒（批號(hào)20215309）、抗體篩選紅細(xì)胞試劑盒（批號(hào)20217012）、抗人球蛋白（抗IgG，C3d）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20195002）均購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；抗-A，B試劑（批號(hào)102154，克隆號(hào)ES4+ES15）購(gòu)自美國(guó)Immucor公司；抗A1試劑（批號(hào)8000248401，植物凝集素）和抗-H試劑（批號(hào)8000258203，荊豆植物凝集素）均購(gòu)自荷蘭Sanquin公司。

2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)試劑：少量全血基因組提取試劑盒（北京原平皓公司）；dNTPs（上海Generay Biotech公司）；MgCl2、10×PCR Buffer、Taq酶均購(gòu)自北京全式金生物公司；TA克隆試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.3 主要儀器：PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystem公司，PE9600）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美

國(guó)Alpha Innotech公司，Alpha Imager EP）；測(cè)序儀（美國(guó)ABI，3730xlDNAAnalyzer）；電泳儀（DYY-Ⅲ-4）和電泳槽（HE-120）均購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

3 方法

3.1 血清學(xué)檢測(cè)：采用標(biāo)準(zhǔn)試管法進(jìn)行ABO正反定型、抗-H、抗-A1、抗-A，B等檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)抗人球法完成抗體篩查試驗(yàn)。

3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)：提取患者外周血DNA。PCR擴(kuò)增ABO基因的全編碼區(qū)、上游CBF/NF-Y增強(qiáng)子區(qū)、啟動(dòng)子和內(nèi)含子1中的紅細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的核苷酸序列。根據(jù)TA克隆試劑盒操作說明書將PCR產(chǎn)物克隆到TA克隆載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取多個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析鑒定其單倍型。PCR擴(kuò)增條件、相關(guān)引物序列及測(cè)序引物序列參照文獻(xiàn)[1-2]。

4 結(jié)果分析 應(yīng)用Chromas軟件閱讀測(cè)序圖譜，BioEdit軟件對(duì)比分析測(cè)序結(jié)果。與GenBank中的序列（NG_006669.1）進(jìn)行比對(duì)，分析結(jié)果。

結(jié) 果

1 血型血清學(xué)試驗(yàn) 血清學(xué)格局提示該患者ABO血型定型正反不符，排除人為因素，初步懷疑其為A亞B型或B（A） 亞型（表1）。

表1 患者血清學(xué)檢測(cè)格局

2ABO基因測(cè)序及單倍型檢測(cè) 對(duì)患者DNA樣本進(jìn)行ABO基因測(cè)序分析，與ABO*A1.01序列比較存在c.297A＞G，c.467C＞T，c.526C＞G，c.657C＞T，c.703G＞A，c.796C＞A，c.803G＞C，c.930G＞A，c.955C＞G雜合變異，提示患者為A/B雜合基因型。采用TA克隆測(cè)序?qū)颊哌M(jìn)行ABO單倍型分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)等位基因?yàn)锳BO*B.01，另一個(gè)等位基因與ABO*A1.01序列比較存在c.467C＞T，c.955C＞G變異，圖1為特異性變異位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。該患者ABO血型的基因型為ABO*A1.02 +c.955C＞G/ ABO*B.01。

圖1 患者普通測(cè)序及克隆測(cè)序部分結(jié)果

討 論

ABO基因位于染色體9q34.2上，A、B血型抗原按照孟德爾遺傳規(guī)律呈共顯性遺傳[3]。ABO主要基因產(chǎn)物的底物特異性是通過區(qū)分A和B等位基因的某些多態(tài)性來確定[4]。紅細(xì)胞上的ABO抗原是由A和B基因編碼的A或B糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）生物合成的。ABO基因多態(tài)性或變異可能會(huì)引起酶的活性或特異性發(fā)生改變而影響ABO表型出現(xiàn)亞型[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不同ABO亞型表現(xiàn)型相關(guān)分子基礎(chǔ)被發(fā)現(xiàn)，這些亞型表型包括但不限于A亞型如A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等，B亞型如B3、Bx、Bm、Bel、Bw等[6]。

本研究中患者血清學(xué)檢測(cè)正定型檢出弱A抗原，反定型檢出弱抗-A1抗體，表型為A亞B型，基因測(cè)序鑒定其基因型為ABO*A1.02+c.955C＞G/ABO*B.01。ABO*A1.02+c.955C＞G等位基因的c.955C＞G（Genbank ID：KJ130041）變異在2017年由蔡曉紅等[7]在中國(guó)漢族人群中首次報(bào)道，除此例外，目前尚未見其他國(guó)內(nèi)外報(bào)道。蔡曉紅等檢測(cè)的患者血清學(xué)正定型為O型，反定型檢出弱抗-A1抗體，通過吸收放散試驗(yàn)才檢出A抗原，即表型為Ael型，經(jīng)過基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)c.955C＞G變異，基因型為A/O。這與本研究中同樣攜帶該變異等位基因的患者血清學(xué)格局不一致，提示即使出現(xiàn)相同的等位基因，但不同等位基因之間的相互作用可能會(huì)導(dǎo)致表型不同，即可能存在等位基因增強(qiáng)或競(jìng)爭(zhēng)作用導(dǎo)致血清學(xué)結(jié)果存在差異。本研究中是由于等位基因增強(qiáng)作用使得Avar表達(dá)水平在Avar/B雜合子時(shí)強(qiáng)于反式位等位基因（trans allele）為O時(shí)，所以在正定型檢測(cè)時(shí)A/B雜合子能夠檢出弱A抗原，而A/O需要通過吸收放散才能檢出。

等位基因增強(qiáng)（Allelic enhancement）是一種基因間的相互作用，其機(jī)制是因反式位等位基因的存在，導(dǎo)致由于變異而表達(dá)減弱的糖基轉(zhuǎn)移酶并未出現(xiàn)表達(dá)減弱，甚至表現(xiàn)酶活性增加的現(xiàn)象[8]。相反，與之對(duì)應(yīng)的還有等位基因競(jìng)爭(zhēng)而出現(xiàn)抗原表達(dá)減弱的現(xiàn)象，即轉(zhuǎn)移酶之間競(jìng)爭(zhēng)共同的受體物質(zhì)，導(dǎo)致抗原表達(dá)降低[9]。1976年SALMON和CARTRON[10]首先描述了等位基因增強(qiáng)的概念，將其定義為ABO*AW或ABO*BW等位基因，其在A/B雜合子中表達(dá)比與O等位基因一起表達(dá)更穩(wěn)定。此后數(shù)個(gè)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)等位基因增強(qiáng)現(xiàn)象進(jìn)行了報(bào)道：例如，STORRY等[11]報(bào)道了一組家系樣本存在等位基因增強(qiáng)現(xiàn)象，先證者ABO*AW.29/O.01.01表型為O型，但是先證者母親ABO*AW.29/B.01表型為A2B，同一ABO*A等位基因的表達(dá)在家族成員中因反式位等位基因不同而存在差異。相似的情況也被MCKNIGHT等[12]發(fā)現(xiàn)，ABO基因分型顯示由ABO*AW.29（c.311T＞A，p.Ile104Asn）編碼的A轉(zhuǎn)移酶具有明顯的可變活性。母親ABO*AW.29/O.01.01表現(xiàn)為O型而新生兒ABO*AW.29/B.01表現(xiàn)為AwB型。這項(xiàng)研究結(jié)果同時(shí)也表明，反式位等位基因的增強(qiáng)作用是決定轉(zhuǎn)移酶活性的重要因素，甚至可能會(huì)抵消新生兒本身年齡因素的影響。不同于以上兩個(gè)針對(duì)白種人群的研究，CHO等[13]在韓國(guó)人群中篩查到ABO*AW.10（c.784G＞A，p.Asp262Asn）在Avar/B雜合子中顯示出等位基因增強(qiáng)。家族研究表明AW.10等位基因在Avar/B雜合子成員中以AwB表現(xiàn)型表達(dá)，而在Avar/O雜合子中以O(shè)表現(xiàn)型表達(dá)。LI等[14]在中國(guó)臺(tái)灣人群中發(fā)現(xiàn)Ax和A3B表型受試者具有相同的ABO*AW.35（c.860C＞T，p.Ala287Val）等位基因。該等位基因在ABO*AW.35/B.01雜合子中表現(xiàn)為A3B表型，而在ABO*AW.35/O.01.01雜合子中為Ax表型。也有家系研究發(fā)現(xiàn)表型為Bx的B基因在A1B成員中表達(dá)增強(qiáng)，在B/O中表達(dá)為Bel，但同一基因在A/B型成員中表型為B3[8]。此外，OLSSON等[4]發(fā)現(xiàn)ABO*AW.31與ABO*O.02.01共同遺傳時(shí)比與ABO*O.01.01一起時(shí)酶活性增強(qiáng)。先證者基因型ABO*AW.31/ABO*O.02.01正定型檢出弱A抗原表型為A亞型，而其母親ABO*AW.31/ABO*O.01.01正定型卻為O型。這可能與ABO*O.01.01和ABO*O.02.01具有重要的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。前者由于外顯子6第261位G缺失（p.Thr88Profs*31），終止密碼子提前出現(xiàn)產(chǎn)生截短的轉(zhuǎn)錄本，而后者能夠產(chǎn)生全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本[12]。這一研究證明等位基因增強(qiáng)并不局限于A/B雜合子，還可能與O基因的變異情況有關(guān)。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究中關(guān)于相同等位基因?qū)?yīng)不同血清學(xué)亞型的情況，大多研究都僅推測(cè)可能是由于不同實(shí)驗(yàn)室使用不同的抗血清試劑的原因，偶有研究提及可能與個(gè)體受到共表達(dá)的另外一個(gè)ABO等位基因的影響有關(guān)但未見論證和討論[6，15-16]。本研究首次在中國(guó)大陸人群中報(bào)道ABO等位基因增強(qiáng)現(xiàn)象并系統(tǒng)綜述其對(duì)血型鑒定的影響。

目前，等位基因增強(qiáng)現(xiàn)象的確切機(jī)制尚不清楚，一種可能的解釋是變異導(dǎo)致的缺陷糖基轉(zhuǎn)移酶可與完整正常的轉(zhuǎn)移酶形成二聚體和異二聚體進(jìn)而彌補(bǔ)缺陷酶的功能[8]。在本研究中，c.955C＞G變異致319位氨基酸殘基由亮氨酸（Leu）改變?yōu)槔i氨酸（Val），亮氨酸和纈氨酸都是帶有碳?xì)鋫?cè)鏈的支鏈氨基酸，且具有疏水性，一般存在于折疊蛋白內(nèi)部的疏水區(qū)域中，對(duì)蛋白折疊和空間構(gòu)象具有重要作用。LEI等[17]對(duì)p.L319V進(jìn)行3D分子模型構(gòu)建與局部結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Leu改變?yōu)閂al并未導(dǎo)致GTA蛋白整體結(jié)構(gòu)的改變，但卻改變了該位點(diǎn)與鄰近氨基酸的靜電作用力，使得V319可與T231及L232形成氫鍵，導(dǎo)致局部構(gòu)象發(fā)生改變。雖有研究證明，體外混合A和B糖基轉(zhuǎn)移酶形成聚合物能夠增強(qiáng)酶的活性[18]，但是KIM等[19]研究發(fā)現(xiàn)，聚合物的形成可能并不會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)酶活性增強(qiáng)。綜合這些研究成果可以看出，對(duì)變異基因?qū)е碌陌被嶙兓M(jìn)行結(jié)構(gòu)建模只是推測(cè)性工作，并不能解釋為什么弱等位基因與另一反式等位基因雜合遺傳時(shí)能增強(qiáng)相應(yīng)抗原表達(dá)。同時(shí)，它是否與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、抗原合成（定量或定性）、細(xì)胞運(yùn)輸或其他過程有關(guān)尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)改變的酶被反式位等位基因增強(qiáng)的確切機(jī)制。

等位基因增強(qiáng)現(xiàn)象多在家系研究中由于血型表型不符合遺傳定律而被發(fā)現(xiàn)，易引起父母和子代之間的血清學(xué)差異，這說明在疑難血型鑒定時(shí)家系調(diào)查的重要性。非常遺憾的是本研究未能獲取患者家系樣本開展調(diào)查，因此除卻本文重點(diǎn)討論的等位基因增強(qiáng)現(xiàn)象之外，也有可能是其他遺傳或環(huán)境因素導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果差異，如不同批次或不同克隆株抗體的檢測(cè)強(qiáng)度差異，存在其他未知的ABO基因調(diào)控序列的改變，或者存在其他未知的表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄/翻譯水平的調(diào)控等。常規(guī)的血清學(xué)方法在鑒定亞型時(shí)存在局限性，采用基因分型技術(shù)精準(zhǔn)確定血型基因型能夠輔助解決這類疑難血型鑒定問題，為亞型患者提供安全的臨床輸血策略。通過綜合分析ABO等位基因的相互作用能夠更好地解釋基因型和表型的差異。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突