楊惠寬 吳千羽 張嘉儀 陳小潔 苑召虎 魏亞明

血小板（platelet，PLT）的輸注目前普遍應(yīng)用于因惡性腫瘤、化療、免疫疾病、感染或遺傳性血小板疾病引起的嚴(yán)重PLT減少或功能異常的患者[1-3]。PLT是從骨髓巨核細(xì)胞釋放出的一種小型、不規(guī)則的細(xì)胞碎片[4]，其黏附、釋放、聚集、收縮和吸附等功能在機(jī)體凝血和止血中發(fā)揮重要作用[5-6]。然而PLT在體外保存過(guò)程中會(huì)發(fā)生聚集、凋亡等影響PLT功能的儲(chǔ)存損傷。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)約22 nt，在人體中具有調(diào)控功能的一類內(nèi)源性非編碼RNA，具有非常廣泛的調(diào)節(jié)功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，在PLT內(nèi)表達(dá)的miRNA參與調(diào)節(jié)PLT內(nèi)部相關(guān)基因的表達(dá)。參與PLT的聚集和黏附反應(yīng)的GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物可作為評(píng)價(jià)PLT功能的指標(biāo)[7]，它在PLT的止血過(guò)程中發(fā)揮重要作用。血小板特異性ADP受體P2Y12和血管舒張刺激磷酸蛋白（vasodilator stimulated phos Phoprotein，VASP）在PLT活化通路上均發(fā)揮重要作用。這些蛋白在體內(nèi)環(huán)境影響PLT的聚集、活化，但在體外儲(chǔ)存條件下的變化及與miRNA的相互作用尚不明確，本文擬通過(guò)儲(chǔ)存血小板miRNA芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，全面分析PLT中的miRNA在不同時(shí)間段表達(dá)量的變化，并觀察其變化與PLT聚集相關(guān)蛋白表達(dá)及其與PLT功能的關(guān)聯(lián)性，探討miRNA作為PLT儲(chǔ)存損傷生物學(xué)標(biāo)記的可行性，以維持PLT保存期間的狀態(tài)，提高臨床輸注療效。

資料與方法

1 研究對(duì)象 本研究PLT選自15例健康成年人，男性，ABO血型為O型，平均年齡33.8（23～55）歲，本研究項(xiàng)目獲醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理證書編碼：K-2018-027-01）。

2 標(biāo)本處理 機(jī)采PLT存放于PLT保存袋中，機(jī)采PLT約200 mL/袋，PLT含量≥2.5×1011/袋，白細(xì)胞含量≤5.0×108/袋，紅細(xì)胞含量≤8.0×109/袋，（22±2）℃下60次/分震蕩保存，在保存的第2、5、8天取樣分裝后放置于-80 ℃冰箱中保存。

3 miRNA表達(dá)譜芯片分析 應(yīng)用human miRNA array（Agilent，United States）檢測(cè)血小板中miRNA的表達(dá)，試驗(yàn)步驟按照Human miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)操作流程。

4 RNA的提取 應(yīng)用TRIzol LS（Ambion，United States）提取血小板RNA，試驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書流程：抽提1.5 mL（PLT計(jì)數(shù)≥1.35×109個(gè)）機(jī)采血小板的RNA，20 μL無(wú)酶水溶解RNA。

5 cDNA和合成 逆轉(zhuǎn)錄RNA采用miRCURY LNATMUniversal cDNA Synthesis Kit（Exiqon， Denmark）試劑配置10 μL反應(yīng)體系：無(wú)酶水5 μL、酶混合液1 μL、5×Reaction buffer 2 μL、模板RNA 2 μL。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，95℃ 5 min。

6 熒光定量PCR驗(yàn)證miRNA 應(yīng)用miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR System試劑盒（Exiqon，Denmark）驗(yàn)證PLT的miRNA表達(dá)。選擇U6作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。miRNA引物、內(nèi)參引物均來(lái)自丹麥Exiqon公司設(shè)計(jì)合成。每個(gè)PCR擴(kuò)增體系為10 μL，含SYBR Green基質(zhì)混合液4.8 μL，稀釋40倍的cDNA 4 μL，引物1 μL以及0.2 μL ROX reference dyeⅡ（TaKaRa，Japan）。

7 FCM檢測(cè)的PLT相關(guān)指標(biāo) 應(yīng)用Annexin V-APC凋亡檢測(cè)試劑盒（KGA1026，KeyGEN，China），通過(guò)FACSVerse流式細(xì)胞儀（BD，United States）檢測(cè)PLT凋亡率。將裝有1.5 mL血小板標(biāo)本的EP管進(jìn)行離心（600 g×5 min，下同），棄去血漿后，加入PBS洗滌1次后離心棄去洗滌液。加入4%的多聚甲醛溶液1 mL固定過(guò)夜。固定后離心，棄去固定液，并用PBS洗滌2次后離心棄去洗滌液。加入500 μL的Binding Buffer懸浮血小板后，再加入5 μL Annexin V-APC混勻，室溫，避光孵育15 min。孵育結(jié)束后，離心，棄去染液，再加入300 μL Binding Buffer重懸血小板，并立即上機(jī)檢測(cè)。

使用FITC標(biāo)記CD41a（BD，United States）、PerCP標(biāo)記CD61（BD，United States）抗體檢測(cè)PLT上GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)情況，取10 μL PLT稀釋成1 mL，分別加入抗體20 μL，混勻后2℃～8℃孵育20 min，立即上機(jī)分析，設(shè)陰性對(duì)照，結(jié)果以CD41a、CD61雙陽(yáng)性表示。

使用VASP檢測(cè)試劑盒（PLT VASP/P2Y12，BIOCYTEX，F(xiàn)rance）檢測(cè)PLT中VASP磷酸化水平及P2Y12活化程度。按說(shuō)明書步驟操作：取10 μL PLT依次加入抗體及其他試劑（含固定液），加樣完成后置于2℃～8℃，24 h內(nèi)分析。依照說(shuō)明書的計(jì)算公式計(jì)算PLT反應(yīng)指數(shù)（platelet reactivity index，PRI），以PRI表示VASP磷酸化程度及P2Y12活化程度。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Tamhane檢驗(yàn)、LSD檢驗(yàn)將各組分別比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 儲(chǔ)存血小板miRNA表達(dá) miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明儲(chǔ)存第5天PLT與第2天相比，47種miRNA表達(dá)上調(diào)，120種miRNA表達(dá)下調(diào)；儲(chǔ)存第8天時(shí)，28種miRNA表達(dá)上調(diào)，202種下調(diào)；而第8天與第5天相比，5種miRNA表達(dá)上調(diào)，16種miRNA下調(diào)。整體而言，表達(dá)降低的miRNA數(shù)量明顯多于升高的數(shù)量，表達(dá)降低的miRNA一般降幅較大，而表達(dá)升高的miRNA多呈小幅度升高。本實(shí)驗(yàn)中白細(xì)胞比例小于0.01%，相關(guān)研究表明當(dāng)白細(xì)胞比例小于0.01%時(shí)，可以忽略白細(xì)胞對(duì)血小板miRNA檢測(cè)的影響[8-9]。

表1 儲(chǔ)存PLT中miRNA 表達(dá)芯片檢測(cè)結(jié)果

2 篩選芯片表達(dá)有差異的miRNA的qPCR驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]和上述miRNA表達(dá)結(jié)果，選擇與PLT活化相關(guān)的miR-223、miR-21-5p和let-7b-3p，以及芯片結(jié)果中表達(dá)量變化較大的miR-21-3p、miR-155和miR-3162進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果提示儲(chǔ)存第5天的血小板miR-21-5p、miR-21-3p和miR-155表達(dá)降低顯著（P＜0.05），而miR-3162、miR-223和let-7b的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），這一結(jié)果與芯片結(jié)果檢測(cè)的變化趨勢(shì)一致（圖1）。

圖1 qRT-PCR驗(yàn)證機(jī)采PLT儲(chǔ)存過(guò)程中6種篩選miRNA的表達(dá)

3 PLT活化聚集信號(hào)通路的預(yù)測(cè) KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的靶基因及根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]推斷的miRNA與PLT相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA調(diào)控相關(guān)的PLT活化途徑及其與PLT聚集的關(guān)系

上圖顯示這幾種miRNA與PLT的激活、活化、聚集功能都密切相關(guān)。miR-223參與調(diào)控P2Y12 miRNA的表達(dá)，控制P2Y12蛋白的合成；miR-21作用于P2Y12；miRNA-96抑制VAMP8蛋白表達(dá)；let-7b通過(guò)負(fù)調(diào)控抑制靶基因GPⅢa。本研究發(fā)現(xiàn)miR-223、let-7b在PLT儲(chǔ)存過(guò)程中表達(dá)升高，而miR-21則在其儲(chǔ)存過(guò)程下降，miR-96的表達(dá)則無(wú)明顯改變。4 儲(chǔ)存過(guò)程中PLT的凋亡 磷脂酰絲氨酸外翻是細(xì)胞凋亡早期的特征，Annexin V可檢測(cè)細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸。Annexin V APC+（%）提示PLT的早期凋亡百分比（圖3）。如表2所示，在三個(gè)樣品中，儲(chǔ)存PLT凋亡率隨時(shí)間增長(zhǎng)而增高，第2天凋亡率為（1.03±0.52）%，第5天為（11.67±1.35）%，儲(chǔ)存至第8天凋亡率可達(dá)（22.73±6.82）%。

圖3 保存不同天數(shù)的機(jī)采PLT在儲(chǔ)存過(guò)程中凋亡率的比較

表2 保存不同天數(shù)機(jī)采PLT在儲(chǔ)存過(guò)程中的凋亡率比較

5 保存過(guò)程中PLT反應(yīng)指數(shù)PRI（platelet reactivity index）變化 血小板聚集功能檢測(cè)受多種因素影響，而VASP檢測(cè)基于P2Y12受體途徑的活化，是特異性最高的P2Y12 受體抑制劑檢測(cè)方法，不受其他抗血小板藥物的影響[13]。VASP在基礎(chǔ)狀態(tài)下處于非磷酸化狀態(tài)，其磷酸化激活過(guò)程中，前列腺素E1（PGE1）會(huì)激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然而這種級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通過(guò)P2Y12蛋白受體被ADP抑制[14]。利用雙色流式細(xì)胞測(cè)定術(shù)，通過(guò)VASP的磷酸化狀態(tài)的測(cè)定，從而檢測(cè)P2Y12受體活性[15]。檢測(cè)中通過(guò)設(shè)門排除其他細(xì)胞碎片的干擾，保留目標(biāo)PLT群。均值MFI表示，MFIcPGE1代表抗VASP-P在PGE1的MFI值，MFIcPGE1=T1 Geo mean-T3 Geo mean。MFIc（PGE1+ADP）代表抗VASP-P在PGE1+ADP條件下的MFI值，MFIc（PGE1＋ADP）= T2 Geo mean - T3 Geo mean。PRI（%） =[（MFIcPGE1-MFIc（PGE1＋ADP））/ MFIcPGE1] ×100%，PRI表示VASP的磷酸化程度，同時(shí)反映P2Y12的活化程度。結(jié)果表明，PLT儲(chǔ)存過(guò)程中VASP磷酸化程度從72.7%不斷降低至18.7%，這預(yù)示著P2Y12的活化在PLT儲(chǔ)存過(guò)程中逐漸增高（表3）。

表3 機(jī)采PLT保存過(guò)程中PLT反應(yīng)性指數(shù)比較

6 保存過(guò)程中PLT中的GPⅡb/Ⅲa表達(dá) 機(jī)采PLT儲(chǔ)存至第2、5、8天時(shí)，PLT膜蛋白CD41a+/CD61+陽(yáng)性率分別為（99.2±0.3）%、（98.9±0.7）%，（98.4±0.7）%， 三組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示機(jī)采PLT中GPⅡb/Ⅲa無(wú)明顯改變，說(shuō)明機(jī)采血小板在儲(chǔ)存過(guò)程中的活化不明顯。

討 論

研究證實(shí)人類PLT中存在大量的miRNA[10]。血小板中miRNA的表達(dá)變化參與了mRNA、蛋白質(zhì)合成及激活的調(diào)控[16-17]，這些變化是血小板自身代謝的一部分，也是體外儲(chǔ)存損傷的一種表現(xiàn)形式。有研究表明人體內(nèi)miR-223和miR-21參與調(diào)控P2Y12 mRNA的表達(dá)和P2Y12蛋白的合成[10]。本研究結(jié)果顯示，機(jī)采PLT在儲(chǔ)存過(guò)程中miR-223表達(dá)量逐步升高，miR-21表達(dá)量逐步下降，而P2Y12在體外儲(chǔ)存過(guò)程活化程度隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增長(zhǎng)而增高。P2Y12是PLT特異性ADP受體，正向調(diào)控PLT的活化，通過(guò)PI3K途徑依賴性抑制Bak/Bax激活P2Y12受體，拮抗PLT凋亡，防止血小板活化能力下降，維持機(jī)體的凝血機(jī)制[11]。研究表明刺激PI3K使P2Y12受體表達(dá)活躍，可進(jìn)一步影響GPⅡb/Ⅲa的激活。GPⅡb/Ⅲa激活是PLT活化的標(biāo)志[15]，本研究表明其在儲(chǔ)存過(guò)程中無(wú)明顯變化，提示機(jī)采PLT儲(chǔ)存過(guò)程中活化聚集不明顯。miRNA對(duì)血小板GPⅡb/Ⅲa具有雙向調(diào)控作用，本研究結(jié)果表明let-7b表達(dá)增高，let-7b通過(guò)負(fù)調(diào)控抑制靶基因GPⅢa，從而阻止PLT活化聚集，維持其正常功能。

本研究還發(fā)現(xiàn)一些未曾報(bào)道的與PLT功能有關(guān)的miRNA，在血小板儲(chǔ)存過(guò)程表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化。如本研究發(fā)現(xiàn)的miR-3162，有文獻(xiàn)報(bào)道其在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的T細(xì)胞中高表達(dá)，功能上與維護(hù)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型有關(guān)[12]。在人臍血CD34+細(xì)胞高表達(dá)的miR-155，參與了早期造血細(xì)胞的分化調(diào)控[18]，而miR-155在造血祖細(xì)胞分化成為巨核細(xì)胞過(guò)程中表達(dá)顯著下降。miR-155表達(dá)的下降可解除其靶基因抑制[19]。miR-155在PLT體外儲(chǔ)存過(guò)程中的表達(dá)下調(diào)，可能是干細(xì)胞分化為巨核細(xì)胞過(guò)程中表達(dá)下降的延續(xù)，即保持對(duì)PLT功能的負(fù)調(diào)控。

很多miRNA是相關(guān)疾病研究中的熱點(diǎn)，但與血小板相關(guān)功能的關(guān)聯(lián)報(bào)道尚不多見(jiàn)。GPⅡb/Ⅲa的激活是PLT聚集的必由之路，通過(guò)let-7b抑制或降低GPⅢa的表達(dá)，進(jìn)而阻斷PLT聚集，可能在治療或預(yù)防血栓中發(fā)揮新的作用[11]。miR-21具有調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的功能，miR-21可調(diào)控PDGF誘導(dǎo)的人類血管平滑肌細(xì)胞增殖和收縮，展示了治療增生性血管疾病的潛能[20]。本研究結(jié)果顯示機(jī)采PLT中miR-21-5p、miR-21-3p的表達(dá)在儲(chǔ)存第5天時(shí)下降超過(guò)40%，這預(yù)示著輸注儲(chǔ)存大于5天的PLT，可導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)量下降，可能具有誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的功能，同時(shí)這表明miR-21-5p和miR-21-3p具有作為儲(chǔ)存損傷分子標(biāo)記和治療分子靶點(diǎn)的潛能。

有研究建議，miR-127與miR-320a表達(dá)的比值可作為儲(chǔ)存PLT的生物學(xué)標(biāo)記，但沒(méi)有說(shuō)明miR-127、miR-320a與PLT活化或凋亡的相關(guān)性[21]。生物信息學(xué)分析表明在PLT活化聚集通路中，miR-223與P2Y12表達(dá)在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生變化并存在相關(guān)性，也與PLT的活化聚集有關(guān)。miR-223在儲(chǔ)存的機(jī)采PLT中保持高表達(dá)，易于檢測(cè)，可以作為PLT儲(chǔ)存的生物學(xué)標(biāo)記。

本文對(duì)機(jī)采PLT儲(chǔ)存過(guò)程中miRNA的變化，與這些變化相關(guān)蛋白表達(dá)，以及與PLT聚集的關(guān)系進(jìn)行了探討和預(yù)測(cè)，結(jié)果表明PLT中含有大量的miRNA，miRNA表達(dá)隨機(jī)采PLT的儲(chǔ)存時(shí)間呈現(xiàn)不同變化，這些表達(dá)變化的miRNA與血小板相應(yīng)的蛋白表達(dá)有關(guān)，并進(jìn)一步影響PLT的聚集功能，少數(shù)miRNA有可能作為PLT體外儲(chǔ)存損傷的生物學(xué)標(biāo)記。如何利用這些miRNA表達(dá)變化，從而延長(zhǎng)PLT保存時(shí)間，減少儲(chǔ)存損傷，維持PLT功能，仍需更深層次的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突