魏志雄 劉丹丹 藍(lán)明雄 王昆鵬 李 儒

1.廣東省東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞 523000

雷尼替丁為常用的H2受體拮抗劑，能競爭性阻滯組胺與H2受體結(jié)合進(jìn)而減少胃酸分泌，具有良好的臨床效果，為消化性潰瘍和胃酸過多等消化道疾病[1-5]的臨床常用藥且價(jià)格實(shí)惠。近年來雷尼替丁及二甲雙胍相繼報(bào)道檢出N-亞硝基二甲胺（N-nitroso dimethylamine，NDMA）雜質(zhì)。NDMA 被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）列為2A 類致癌物質(zhì)，在人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（The Inter national Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）M7 中被列為第一類基因毒性雜質(zhì)，具較強(qiáng)的致癌、致畸和致突變毒性[6-9]。為保證藥品的安全和質(zhì)量可控，實(shí)現(xiàn)有效的風(fēng)險(xiǎn)控制，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[10]，為亞硝胺類雜質(zhì)的研究和控制提供指導(dǎo)。目前國內(nèi)藥品中NDMA 檢測的文獻(xiàn)報(bào)道[11-20]主要集中在沙坦類、二甲雙胍類及替丁類等，采用靜電場軌道阱（Orbitrap）高分辨質(zhì)譜檢測雷尼替丁中NDMA 含量方法未見報(bào)道。為進(jìn)一步評估雷尼替丁及其制劑中NDMA 雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，本研究建立一種高靈敏、高質(zhì)量精度的液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（HPLC-Orbitrap HRMS）測定雷尼替丁及其制劑中NDMA 含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Q Exactive Focus 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo fisher Scientific Inc.）；梅特勒XS205DU 電子天平（瑞士Mettler Toledo）；XW-80A 渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；CPX5800HC 超聲波提取器（美國BRANSON）；WB-14 恒溫水浴鍋（含振蕩單元，德國MEMMERT）。

1.2 試劑與材料

NDMA 對照品：Sigma-aldrich，批號(hào)：LRAC1995，濃度：5000 μg/ml（甲醇溶液）；甲醇：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；乙腈：色譜純，默克化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：JA107530；無水甲酸：色譜純，天津科密歐試劑廠，批號(hào)：180603；水為超純水；一次性使用無菌注射器（山東新華安得醫(yī)療用品有限公司）；0.22 μm 微孔濾膜：有機(jī)系，規(guī)格：13 mm，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

樣品共計(jì)7 批，其中5 批原料藥、2 批制劑（含2批制劑對應(yīng)批號(hào)輔料），均為企業(yè)委托檢驗(yàn)提供，分別為鹽酸雷尼替?。荷a(chǎn)企業(yè)一，批號(hào)：20171137、20170158；生產(chǎn)企業(yè)二，批號(hào)：20170901、20170902、20170903。鹽酸雷尼替丁膠囊：生產(chǎn)企業(yè)三，批號(hào)：190501；生產(chǎn)企業(yè)四，批號(hào)：1810249。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密吸取NDMA 對照品溶液0.2 ml，置20 ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度為50 μg/ml 的儲(chǔ)備液①；精密吸取對照品儲(chǔ)備液①1 ml，置50 ml 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1 μg/ml 的儲(chǔ)備液②；再分別精密吸取上述儲(chǔ)備液②適量，用甲醇稀釋制成1、2、5、10、20、50、75 ng/ml 的系列質(zhì)量濃度對照品溶液。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 鹽酸雷尼替丁樣品溶液 取雷尼替丁供試品約300 mg，精密稱定，置于10 ml 容量瓶中，加入5 ml 甲醇，渦旋1 min 使其溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 鹽酸雷尼替丁膠囊樣品溶液 精密稱取樣品內(nèi)容物適量（約相當(dāng)于雷尼替丁300 mg）至50 ml 離心管中，精密加入甲醇10 ml，渦旋混勻1 min，再振搖40 min，離心，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 空白試劑溶液及制劑輔料溶液 取10 ml 量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得空白試劑溶液。

2.3 測定條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACE EXCEL 3 C18-AR（4.6 mm×100 mm，3 μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣器溫度：4℃；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B：含0.1%甲酸的乙腈，按表1 梯度洗脫。流速：0.5 ml/min；進(jìn)樣體積：5 μl；NDMA 在3～5 min 時(shí)間段內(nèi)出峰。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用四級(jí)桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，掃描模式：正離子平行反應(yīng)監(jiān)測（positive ion parallel reaction monitoring，PRM）；以電噴霧（ESI 源）離子化，掃描范圍：m/z50～95，掃描：m/z75.0553，隔離窗口：m/z1.5，碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：30。離子傳輸管溫度：350℃；輔助氣加熱溫度：400℃；鞘氣流速：55 arb；輔助氣流速：15 arb；噴霧電壓：3.5 kV。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取輔料陰性對照溶液、空白試劑溶液、對照品溶液（2 ng/ml）和樣品溶液分別進(jìn)樣測定，與NDMA 的相同保留時(shí)間處均無干擾，見圖1，表明方法的專屬性良好。

圖1 專屬性質(zhì)量色譜圖

2.4.2 線性范圍 取“2.1”中各系列質(zhì)量濃度對照品溶液5 μl 依次注入液質(zhì)聯(lián)用儀，測定NDMA 峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)“Y”，以系列質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)“X”，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2，得到回歸方程：Y=351720X-394458（r=0.9990）。結(jié)果表明NDMA 在1～75 ng/ml 范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 NDMA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4.3 精密度 取質(zhì)量濃度為2、20 ng/ml 的對照品溶液各5 μl 分別連續(xù)6 次注入液質(zhì)聯(lián)用儀測定，結(jié)果顯示NDMA 峰面積的RSD分別為0.5%和1.3%，表明方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性 精密吸取質(zhì)量濃度為2 ng/ml 對照品溶液5 μl 分別在0、2、4、8、12 h 注入液質(zhì)聯(lián)用儀測定。結(jié)果顯示NDMA 峰面積的RSD為1.6%，表明方法中NDMA 在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性 取鹽酸雷尼替丁樣品（批號(hào)：20170902）按“2.2.1”方法制備6 份，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄峰面積。結(jié)果顯示該批樣品中NDMA 的平均含量為2.07 μg/g，RSD值為1.4%（n=6），說明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加標(biāo)回收率 取鹽酸雷尼替丁樣品（批號(hào)：20170902）約300 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，精密加入濃度為1 μg/ml 的NDMA 儲(chǔ)備液②0.3 ml，再按“2.2.1”方法制得加標(biāo)回收溶液。依次精密吸取上述加標(biāo)回收溶液各5 μl 注入液質(zhì)聯(lián)用儀測定，結(jié)果見表2，平均回收率為101.7%，RSD為2.5%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.7 檢出限及定量限 精密吸取質(zhì)量濃度為1 ng/ml的對照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋成不同濃度的溶液，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄譜圖。以信噪比（signal/noise，S/N）約為3 為檢出限，以S/N 約為10 為定量限，結(jié)果檢出濃度為0.03 ng/ml，方法檢出限為0.001 μg/g；定量濃度為0.10 ng/ml，方法定量限為0.003 μg/g。

2.4.8 樣品測定 按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件測定來自4 家企業(yè)共7 批鹽酸雷尼替丁及鹽酸雷尼替丁膠囊樣品，測定結(jié)果見表3，相關(guān)質(zhì)量色譜圖見圖3。

圖3 相關(guān)質(zhì)量色譜圖

表3 樣品測定結(jié)果

3 討論

本研究進(jìn)行流動(dòng)相篩選時(shí)，考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸的水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸的水溶液及0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸的水溶液等5個(gè)類別的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸的水溶液的分離效果及質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)最好。考慮到雷尼替丁受溫度及儲(chǔ)存的影響會(huì)降解產(chǎn)生NDMA，應(yīng)盡量避免樣品在檢測過程中的分解，故自動(dòng)進(jìn)樣器溫度控制為4℃。柱溫選擇中，考察了30、35、40℃柱溫與分離效果和響應(yīng)信號(hào)之間關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果表明無顯著差別，本法選擇30℃柱溫。此外，還對樣品前處理進(jìn)行了考察，分別考察振搖時(shí)間為40、60、90 min 時(shí)樣品的測定結(jié)果，結(jié)果無顯著差異，故選擇振搖時(shí)間為40 min。

按照《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[10]規(guī)定NDMA 的可接受攝入限度為96 ng/d，鹽酸雷尼替丁膠囊的最大攝入量為300 mg/d，故雷尼替丁膠囊中NDMA 的允許限度為0.32 ppm。7 批樣品的檢測結(jié)果顯示有4 批鹽酸雷尼替丁原料藥和1 批鹽酸雷尼替丁膠囊NDMA 含量超出允許限度，故反映該類制劑仍存在一定風(fēng)險(xiǎn)，原料藥及制劑生產(chǎn)企業(yè)需進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝，盡量降低制劑中NDMA 雜質(zhì)，切實(shí)落實(shí)企業(yè)主體責(zé)任，保障患者用藥安全。

綜上所述，本研究采用HPLC-Orbitrap HRMS 法建立了一種測定雷尼替丁及其制劑中痕量NDMA 的檢測方法。方法中NDMA 在1～75 ng/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出濃度和定量濃度分別為0.03 ng/ml 和0.10 ng/ml，加標(biāo)樣品回收率97.4%～105.2%，RSD為2.5%（n=6）。本方法專屬、靈敏、準(zhǔn)確、簡便，可應(yīng)用于雷尼替丁類原料藥及其制劑中痕量NDMA 的檢測，可為生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制及雷尼替丁類NDMA 檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考，亦可為藥監(jiān)部門的監(jiān)管提供技術(shù)支持。