楊攀平，丁炎，仲夢(mèng)園，李銳，呂璨，徐江南， 孫恬晉，盧河?xùn)|,2*

(1.淮陰工學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223001；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，又名脲烷(urethane)，是一種廣泛存在于各種發(fā)酵食品、飲料、煙草和被污染的環(huán)境空氣中的致癌物[1-2]，因其對(duì)人體有潛在的致毒性和致癌性，2007年被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心(IARC)列為2A類致癌物[3]。研究表明氨基甲酸乙酯普遍存在于調(diào)味品(醬油、食醋)和發(fā)酵飲品(白酒、黃酒)中，人體不可避免地暴露其中[4]，因此探索有效可行的降解氨基甲酸乙酯的方法對(duì)保障食品安全具有重要意義。

隨著人們生活水平和生活質(zhì)量的提高，食品安全問題成為社會(huì)熱點(diǎn)[5]。目前有效減除食品中殘留的氨基甲酸乙酯常用方法有減少氨基甲酸乙酯生物合成的前體物質(zhì)[6]；通過高通量篩選技術(shù)和基因工程技術(shù)分離或者改造具有脲酶活性和氨基甲酸乙酯水解酶活性的菌株以及優(yōu)化發(fā)酵工藝[7]等?；诔杀竞蜕锇踩缘纫蛩叵拗疲粩嗤诰騼?yōu)質(zhì)食源性氨基甲酸乙酯降解菌株成為經(jīng)濟(jì)、有效的防控途徑。

本實(shí)驗(yàn)從甜酒酒曲中篩選到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及16S rDNA基因序列分析進(jìn)行種屬鑒定，采用單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)分析得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組合和發(fā)酵條件，以期為后續(xù)的生產(chǎn)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

湖北宜昌甜酒酒曲。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

大豆蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖(均為分析純?cè)噭?：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅、硫酸銨、氯化銨、氨基甲酸乙酯、溴甲酚紫、苯酚、次氯酸鈉、亞硝基鐵氰化鈉：阿拉丁公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(E.Z.N.A.DNA Bacterial DNA Kit)：北京諾博萊德科技有限公司。

Eppendorf冷凍離心機(jī)、Eppendorf PCR儀、Eppendorf 移液槍 德國(guó)Eppendorf股份有限公司；722紫外分光光度計(jì)、電泳儀。

顯色劑 Ⅰ：準(zhǔn)確稱取苯酚60 g、亞硝基鐵氰化鈉2.5 g定容于1 L水中后于冰箱中冷藏；顯色劑Ⅱ：準(zhǔn)確稱取52.5 g NaOH、30 mL次氯酸鈉定容于1 L容量瓶后于冰箱中冷藏；終止劑：10%的三氯乙酸。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，2%(W/V)瓊脂。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0，固體培養(yǎng)基加入2%(W/V)瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：酵母粉24 g/L，蛋白胨12 g/L，甘油5 g/L，KH2PO42.32 g/L，溴甲酚紫1.0 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：牛肉浸膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶菌株的篩選

1.2.1.1 高溫培養(yǎng)法

將甜酒酒曲粉碎混勻，準(zhǔn)確稱取5 g置于50 mL無菌水中，在180 r/min的搖床中振蕩20 min，將菌懸液進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐舛忍荻认♂?，?00 L稀釋液涂布于肉湯培養(yǎng)基上，在50 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 高鹽處理法

將甜酒酒曲粉碎后，準(zhǔn)確稱取5 g置于50 mL無菌水中，于37 ℃，180 r/min搖床中振蕩20 min。菌懸液經(jīng)過適當(dāng)?shù)南♂尯笕?00 μL涂布于高鹽培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

初篩：待平板長(zhǎng)出菌落后，用記號(hào)筆標(biāo)記并將菌落轉(zhuǎn)移至裝有篩選培養(yǎng)基的96深孔板中，于恒溫振蕩器(37 ℃，200 r/min)中培養(yǎng)24 h，選取培養(yǎng)基變?yōu)樽仙木w作為初篩得到的目的菌株。

復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種至裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在37 ℃的搖床中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min。將菌液置于離心管中，于冷凍離心機(jī)(4 ℃)中5500 r/min離心10 min，并用 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體，制備混懸液，在0 ℃下進(jìn)行超聲破碎，待菌液變澄清為止，并檢測(cè)酶活。

1.2.2 產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的菌株鑒定

1.2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

將復(fù)篩所選菌株經(jīng)染色、光學(xué)顯微鏡觀察菌體個(gè)體及群體形態(tài)，生理生化反應(yīng)參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[8-9]。

1.2.2.2 16S rDNA 基因序列分析

參照Omega革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行提取，提取篩選菌株的基因組，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast序列比對(duì)分析，利用MEGA 9.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 氨基甲酸乙酯酶活測(cè)定方法

1.2.3.1 氨基甲酸乙酯酶活定義

在常壓37 ℃，pH 7的條件下，每1 min分解1 nmol氨或1 nmol乙醇的酶量為1個(gè)酶活單位(U)[10]。

1.2.3.2 酶活測(cè)定方法——Berthelot reaction

用比色法測(cè)定氨基甲酸乙酯水解酶的酶活，取酶液1 mL，加入1 mL 3%氨基甲酸乙酯溶液，37 ℃反應(yīng)30 min，加入1 mL終止液，37 ℃反應(yīng)30 min，加入1 mL終止液，混勻后加入1 mL顯色劑Ⅰ和1 mL顯色劑Ⅱ，強(qiáng)烈振蕩，37 ℃保溫20 min后取出，用超純水稀釋到10 mL，在625 nm處比色，并記錄OD值[11]。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用氯化銨配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在625 nm下測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 NH4Cl 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of NH4Cl

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

按3%的接種量對(duì)氮源、碳源、金屬離子(Cu2+、Mn2+、Fe3+、Mg2+)等培養(yǎng)基條件進(jìn)行設(shè)計(jì)，24 h后取樣測(cè)定氨基甲酸乙酯水解酶活性。

1.2.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化

選用溫度、pH、接種量和裝液量等發(fā)酵條件，24 h后取樣測(cè)定氨基甲酸乙酯水解酶活性，研究其對(duì)解淀粉芽孢桿菌氨基甲酸乙酯水解酶活性的影響。

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn)(設(shè)計(jì)正交表)

選取單因素實(shí)驗(yàn)中對(duì)解淀粉芽孢桿菌酶活性影響顯著的3個(gè)因素(氮源濃度、碳源濃度、金屬離子)進(jìn)行三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)(見表1)，以菌株分解EC的活性為考察指標(biāo)，探究該菌株的最佳產(chǎn)酶條件。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2019b 作圖，采用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)均為3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選

經(jīng)過不同的初篩條件從甜酒酒曲中分離活的23株菌，通過篩選培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，篩選出能夠產(chǎn)生氨基甲酸乙酯水解酶的兩株菌LPB-13和LPB-19。將其接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后利用Berthelot reaction 比色法測(cè)定酶活性，LPB-13的酶活為360 U/L，LPB-19的酶活為820 U/L。結(jié)果表明，兩株菌的氨基甲酸乙酯水解酶活性差異顯著，其中LPB-19的酶活性更強(qiáng)，因此將其作為后續(xù)的發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)象。

2.2 氨基甲酸乙酯水解酶產(chǎn)生菌株形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

菌株 LPB-19呈短桿狀，染色均勻，革蘭氏染色陽(yáng)性，可形成內(nèi)生孢子，在液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng),培養(yǎng)基表面形成菌膜。在LB培養(yǎng)基上呈白色不透明菌落，菌落邊緣不規(guī)則，濕潤(rùn)有黏性。接觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性。該菌株需氧生長(zhǎng)；甲基紅陰性；石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶使牛奶胨化；產(chǎn)凝乳酶使牛奶凝固，能水解淀粉，耐受10%的NaCl。糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，不能利用鼠李糖、D-木糖、α-乳糖，結(jié)果見表2。通過上述形態(tài)及生理生化特征，初步將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。鑒于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為近源種，且生理特征接近，為了更進(jìn)一步分離枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了16S rDNA序列分析。

表2 菌株 LPB-19生理生化特性Table 2 The physiological and biochemical properties of strain LPB-19

續(xù) 表

2.3 氨基甲酸乙酯水解酶產(chǎn)生株16S rDNA基因序列分析

以菌株LPB-19基因組DNA為模板，利用16S rDNA通用引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行測(cè)序，對(duì)該序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示菌株LPB-19與B.amyloliquefaciensDSW 7相似性達(dá)到99.4%，利用 MEGA 4.1構(gòu)建菌種系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。結(jié)合前期形態(tài)學(xué)及生理生化分析結(jié)果，菌株LPB-19被鑒定為B.amyloliquefaciens。

圖2 B. amyloliquefaciens LPB-19 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 The phylogenetic tree analysis of B. amyloliquefaciens LPB-19 16S rDNA gene

2.4 培養(yǎng)基成分對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.1 碳源及其濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

碳源對(duì)菌珠L(zhǎng)PB-19酶活性的影響見圖3。解淀粉芽孢桿菌LPB-19均能利用果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖，以麥芽糖為碳源時(shí)菌體生長(zhǎng)最為旺盛，其氨基甲酸乙酯水解酶活性最高；其次為蔗糖，其中以果糖為碳源的菌株的生物量最小，菌株的酶活最低；相比之下，菌株在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中主要以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主，其菌體干重僅次于麥芽糖，但菌株的產(chǎn)酶活性較低(見圖3中a)。由于麥芽糖生產(chǎn)成本高，市場(chǎng)價(jià)格較為昂貴，考慮到工業(yè)化生產(chǎn)成本，選擇蔗糖為碳源?？疾觳煌瑵舛鹊恼崽菍?duì)產(chǎn)酶量的影響，最佳濃度為20 g/L，產(chǎn)酶活力為2367.5 U/L(見圖3中b)。

2.4.2 氮源及其濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)菌珠酶活性的影響見圖4。以蛋白胨為氮源時(shí)菌株的產(chǎn)酶活性最高，而菌株在無機(jī)氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量低，與有機(jī)氮的差異顯著，故以蛋白胨為氮源。同時(shí)，可以看出蛋白胨的最佳濃度為10 g/L，產(chǎn)酶活性提高至2117 U/L。

2.4.3 金屬離子對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選用4種常見金屬離子Cu2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+，探究了不同質(zhì)量濃度的金屬離子對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)氨基甲酸乙酯水解酶的影響，結(jié)果見表3。

表3 4種金屬離子不同濃度對(duì)酶活的影響Table 3 Effects of different concentration of four metal ions on urethanase activity

由表3可知，不同質(zhì)量濃度和種類的金屬離子對(duì)菌株的產(chǎn)酶有不同的影響，其中添加Cu2+、Mn2+、Fe3+時(shí)不利于產(chǎn)酶，而添加Mg2+至0.05 g/L時(shí)，菌株的酶活性為1604.4 U/L，相比于優(yōu)化前提高了2倍，選擇Mg2+的最適濃度為0.05 g/L。

2.5 菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖5可知，解淀粉芽孢桿菌LPB-19在31～37 ℃生長(zhǎng)狀況差異不顯著，但在33 ℃時(shí)酶活最高(見圖5中a)。在33 ℃條件下，LPB-19在pH值5～8范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，而在pH 6時(shí)酶活最高(見圖5中b)；在33 ℃，pH 6的條件下，150 r/min下的菌體干重顯著低于180，210，240 r/min，而180 r/min下LPB-19的酶活性顯著高于其他轉(zhuǎn)速(見圖5中c)；在上述優(yōu)化條件下，接種量為3%時(shí)菌株具有較高的酶活(見圖5中d)。綜上所述，解淀粉芽孢桿菌LPB-19在33 ℃、pH 6、轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量3%時(shí)具有較高的酶活性。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，對(duì)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果再設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)蔗糖濃度、蛋白胨濃度和硫酸鎂濃度3個(gè)因素之間的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步的探索，結(jié)果見表4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的Kn和R值，得出最佳發(fā)酵方案是A3B2C2，即蔗糖25 g/L，蛋白胨12.5 g/L，硫酸鎂0.075 g/L，此時(shí)的酶活性為4477.02 U/L，是優(yōu)化前的5.45倍。

表 4 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Orthogonal test results and analysis of enzyme production conditions optimization

3 討論

氨基甲酸乙酯是一種廣泛存在于各種調(diào)味品、發(fā)酵飲品、煙草以及被污染的環(huán)境空氣中的2A類致癌物[12]，是一種對(duì)位點(diǎn)致癌物，能誘發(fā)肺癌和淋巴癌等疾病，其毒理作用也隨著作用時(shí)間和劑量的增加而增強(qiáng)[13]。氰化物和尿素是氨基甲酸乙酯的重要前體物質(zhì)，在食品發(fā)酵過程中可與乙醇作用產(chǎn)生EC，因此減少其在發(fā)酵過程中的積累對(duì)降低EC至關(guān)重要[14]。本實(shí)驗(yàn)從甜酒酒曲中分離篩選獲得一株內(nèi)源性氨基甲酸乙酯水解活性的菌株，經(jīng)生物學(xué)鑒定確定為B.amyloliquefaciensLPB-19。

解淀粉芽孢桿菌廣泛存在于食物、土壤、植物、動(dòng)物以及一些極端的環(huán)境中，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已將其列為安全無毒的微生物，且基于其優(yōu)越的生物學(xué)功能，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等各個(gè)領(lǐng)域中[15-16]，本實(shí)驗(yàn)從甜酒酒曲中篩選的菌株LPB-19能適應(yīng)多種環(huán)境，氨基甲酸乙酯降解性能穩(wěn)定且屬于食品安全菌株，相比于酵母菌Y13[17]，其去除氨基甲酸乙酯更具有優(yōu)勢(shì)。丁霞等[18]從白酒酒醅中篩選出一株同時(shí)能降解氨基甲酸乙酯及其前體尿素的解淀粉芽孢桿菌。孟慶達(dá)[19]從白酒酒曲中篩選出高脲酶活性的腐生葡萄球菌，其尿素和氨基甲酸乙酯去除率分別為78.8%、50.3%。李京京等[20]從小鼠腸道篩選出具有降解氨基甲酸乙酯活性的賴氨酸芽孢桿菌SC02，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，最終氨基甲酸乙酯降解酶活高達(dá)7066 U/L，與原始培養(yǎng)基的酶活相比提高了350%，說明菌株的氨基甲酸乙酯水解活性受到培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件以及復(fù)雜的代謝調(diào)控影響[21]，在本實(shí)驗(yàn)中也得到了相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過發(fā)酵條件和培養(yǎng)基組分優(yōu)化，最終氨基甲酸乙酯降解酶酶活達(dá)到4477 U/L，相比于原始培養(yǎng)基提高了432%。該菌產(chǎn)生最大的氨基甲酸乙酯水解活性在6.0左右，說明降解氨基甲酸乙酯的物質(zhì)具有較好的耐酸性，這與已報(bào)道的氨基甲酸乙酯降解菌株膠紅酵母、賴氨酸芽孢桿菌和肺炎克雷伯氏菌的最適pH 7.0不同[22]，而發(fā)酵體系常以酸性環(huán)境為主，由此看來，本實(shí)驗(yàn)獲得的解淀粉芽孢桿菌LPB-19在去除氨基甲酸乙酯方面更具有優(yōu)勢(shì)，因此其在食品發(fā)酵中更具有應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)B.amyloliquefaciensLPB-19菌株的培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行該菌株的氨基甲酸乙酯降解活性評(píng)估，結(jié)果表明LPB-19具有較高的氨基甲酸乙酯降解活性，具有降解釀造類調(diào)味品、發(fā)酵飲品中氨基甲酸乙酯的潛力。在后續(xù)的研究中，我們將進(jìn)行氨基甲酸乙酯降解酶的分離、鑒定和純化以及通過基因工程方法進(jìn)行菌株改造，構(gòu)建生物相容性高、降解活性強(qiáng)的工程菌株，以期可將具有EC降解活性的解淀粉芽孢桿菌作為發(fā)酵劑直接加入調(diào)味品或者發(fā)酵飲品的釀造體系中，降解氨基甲酸乙酯，保障食品安全。