田雪，趙麗君，莫曉慧，段飛霞,2*

(1.四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610065；2.食品科學(xué)與技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065)

細(xì)菌生物膜是菌體細(xì)胞聚集、附著在固體表面或氣液界面而形成的生物活性基質(zhì)[1]；對(duì)鹽濃度、干燥、高溫、抗生素、滅菌劑和食品防腐劑具有高度的耐受性[2]。食源性病原菌蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)極易污染米飯、乳品、豆制品、果蔬表面及禽畜產(chǎn)品，在各類(lèi)食品中均有檢出，某些亞群可產(chǎn)生耐高溫嘔吐毒素[3]，引發(fā)嚴(yán)重的食物中毒和食品腐敗[4-6]。蠟樣芽孢桿菌易形成高抗性、難清除的生物膜，是導(dǎo)致加工中反復(fù)交叉污染和加工后污染的主要原因[7-8]。現(xiàn)有研究表明，含氯消毒劑，如次氯酸鈉、季銨鹽等，與高壓水清洗聯(lián)用，尚不能有效清除蠟樣芽孢桿菌生物膜，且易損傷食品原料，產(chǎn)生消毒劑殘留，增加微生物耐藥風(fēng)險(xiǎn)，亟待研究新的菌膜清除策略[9]。

微酸性電解水(SAEW)，是刺激性相對(duì)較低的含氯消毒劑，用于食品及醫(yī)藥工業(yè)[10-11]。植物香料天然精油是抗菌和抗細(xì)菌生物被膜的潛在資源[12]。(+)-4-萜品醇為含氧單環(huán)單萜化合物，呈清淡的木香味，是羅勒、牛至、香葉等香料及茶樹(shù)精油的重要組分[13]。含(+)-4-萜品醇植物精油多具有抑菌活性，但(+)-4-萜品醇單體化合物的抑菌和清除細(xì)菌生物膜作用尚不明確[14]。

本文采用結(jié)晶紫法等研究了(+)-4-萜品醇對(duì)蠟樣芽孢桿菌等多種食源性病原菌的抑菌作用和生物膜清除能力，探究其與SAEW的協(xié)同作用；采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FESEM)，觀察(+)-4-萜品醇和SAEW對(duì)常見(jiàn)食品加工接觸表面蠟樣芽孢桿菌混菌生物膜的清除及對(duì)微觀結(jié)構(gòu)的影響，為探索安全、高效、低殘留的混菌生物膜清除方法提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基；聚氨酯板(PU)：規(guī)格10 mm×10 mm；聚氯乙烯(PVC)：規(guī)格10 mm×10 mm；(+)-4-萜品醇：CAS號(hào)2438-10-0；SAEW：有效氯濃度高于120 μg/mL。

1.2 菌種

蠟樣芽孢桿菌(BacilluscereusATCC 14579)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(SalmonellatyphimuriumATCC 14028)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、阪崎克羅諾桿菌(CronobactersakazakiiATCC 29544)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)：購(gòu)自ATCC美國(guó)典型生物資源保藏中心。

1.3 菌種培養(yǎng)

LB肉湯、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基于121 ℃滅菌15 min備用；蠟樣芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種后于37 ℃恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4 最低抑菌濃度測(cè)定

按照馮林慧等[15]的方法測(cè)定不同濃度(+)-4-萜品醇、SAEW及二者聯(lián)用時(shí)不同細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同菌液，用無(wú)菌TSB接種于96孔板中，接種濃度按麥?zhǔn)媳葷岫?.05計(jì)，分別加入0～128 μmol/mL (+)-4-萜品醇、0～96 μg/mL SAEW，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，采用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)定各孔吸光度值[16]。對(duì)照及每個(gè)濃度組均設(shè)置3組平行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)[17]。

1.5 生物膜的清除

按照柴旭鋒等[18]的方法清除已形成的生物膜。聚氨酯、聚氯乙烯小塊滅菌后，用95%乙醇淋洗3～5次待用。吸取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液分別接種于96孔板和6孔板中，接種濃度按麥?zhǔn)媳葷岫?.05計(jì)，6孔板中放入聚氨酯、聚氯乙烯小塊，96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，6孔板培養(yǎng)72 h后，各孔加入不同濃度的(+)-4-萜品醇、SAEW和采用SAEW溶解的(+)-4-萜品醇溶液，暗室靜置30 min。96孔板中各孔輕輕吸去自由漂浮的細(xì)胞及培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS緩沖液清洗2次，使其風(fēng)干待測(cè)。取出6孔板中聚氨酯、聚氯乙烯小塊，待測(cè)。

1.6 結(jié)晶紫法測(cè)定菌膜殘留量

按照張君怡等[19]的方法測(cè)定菌膜殘留量。向每孔中加入200 μL甲醇固定15 min，倒扣傾出甲醇，風(fēng)干后每孔加入200 μL 0.10%的結(jié)晶紫染色液，染色15 min，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌3次并風(fēng)干；每孔加入200 μL 33% 冰乙酸，靜置5～15 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度[20]。對(duì)照及每個(gè)濃度組均設(shè)置3組平行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 FESEM觀察

將1.5中聚氨酯、聚氯乙烯小塊置于2.5%戊二醛的溶液中，在4 ℃下固定15 h，用無(wú)菌水洗滌、晾干，用乙醇溶液(10%、30%、50%、70%、90%和95%)梯度脫水處理，各梯度脫水15 min后風(fēng)干。樣品置于高真空蒸發(fā)器中，噴金鍍膜，用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察細(xì)菌生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，標(biāo)準(zhǔn)差在各圖中用誤差線表示。采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 (+)-4-萜品醇抑菌作用

不同濃度(+)-4-萜品醇作用下，常見(jiàn)食源性病原菌革蘭氏陽(yáng)性(G+)菌蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性(G-)菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。

圖1 (+)-4-萜品醇作用下蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)情況Fig.1 The growth situations of B. cereus, S. aureus, E. coli, C. sakazakii, S. typhimurium and P. aeruginosa in the presence of (+)-4-terpineol

由圖1可知，(+)-4-萜品醇對(duì)G+菌和G-菌都具有顯著的抑菌作用，對(duì)蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用顯著，其最低抑菌濃度(MIC)為8 μmol/L；對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的抑菌濃度最好，其MIC為2 μmol/L，對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為128 μmol/L。

2.2 (+)-4-萜品醇與SAEW的協(xié)同抑菌作用

2.2.1 對(duì)純培養(yǎng)食源性病原菌的協(xié)同抑菌作用

(+)-4-萜品醇與SAEW對(duì)6種純培養(yǎng)食源性病原菌的生長(zhǎng)抑制的協(xié)同作用見(jiàn)圖2。

由圖2可知，0～96 μg/mL的SAEW對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用隨著處理濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。96 μg/mL的SAEW對(duì)蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的抑制率分別為36%、48%、35%、30%、37%和40%。

采用4 μmol/mL(1/2 MIC)(+)-4-萜品醇與SAEW同時(shí)處理時(shí)，96 μg/mL的SAEW對(duì)上述細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制率提高到85%、84%、59%、56%、90%和42%；其中，對(duì)蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的協(xié)同抑菌效果最佳。6 μmol/mL的(+)-4-萜品醇單獨(dú)作用，可完全抑制大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，與12 μg/mL的SAEW協(xié)同作用即可完全抑制金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)。8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇完全抑制了銅綠假單胞菌以外的其他5種食源性病原菌，與SAEW同時(shí)處理對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的抑制作用也不顯著，可能與(+)-4-萜品醇自身的抑菌作用特點(diǎn)有關(guān)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAEW在0～96 μg/mL的濃度范圍內(nèi)不能完全抑制蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌和銅綠假單胞菌單一菌種培養(yǎng)物的生長(zhǎng)；(+)-4-萜品醇與SAEW存在協(xié)同抑菌作用，對(duì)蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用最為顯著。

2.2.2 對(duì)混菌生長(zhǎng)的協(xié)同抑制作用

(+)-4-萜品醇與SAEW對(duì)蠟樣芽孢桿菌混菌生長(zhǎng)抑制的協(xié)同作用見(jiàn)圖3。

由圖3可知，單獨(dú)使用微酸性電解水作用于混菌時(shí)，隨著SAEW濃度的增大，混菌的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，96 μg/mL的SAEW對(duì)蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌及6種菌混合培養(yǎng)物生長(zhǎng)的抑制率分別為32%、36%、34%、29%、25%和36%，略低于對(duì)單一培養(yǎng)物的抑制率。

采用6 mmol/L的(+)-4-萜品醇與不同濃度SAEW同時(shí)處理，達(dá)到上述程度抑制率所需SAEW的濃度下降為12，24，12，36，0，24 μg/mL；完全抑制蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌及6種混菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)所需SAEW濃度分別為96，84，96，24，96 μg/mL。(+)-4-萜品醇的濃度為8 μg/mL時(shí)，可完全抑制蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及6種菌混合培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，與12 μg/mL的SAEW同時(shí)處理能夠完全抑制蠟樣芽孢桿菌與阪崎腸桿菌混菌的生長(zhǎng)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0～96 μg/mL的SAEW不能完全抑制蠟樣芽孢桿菌混菌的生長(zhǎng)；(+)-4-萜品醇與SAEW對(duì)蠟樣芽孢桿菌混菌的生長(zhǎng)同樣具有協(xié)同抑制作用，但作用濃度略高于單一培養(yǎng)物，對(duì)蠟樣芽孢桿菌與鼠傷寒沙門(mén)氏菌混菌生長(zhǎng)的抑制作用最為顯著。

2.3 (+)-4-萜品醇對(duì)細(xì)菌生物膜的清除作用

(+)-4-萜品醇、SAEW對(duì)96孔板中培養(yǎng)48 h后的各類(lèi)細(xì)菌生物被膜的清除作用見(jiàn)圖4中A和B。(+)-4-萜品醇在8～16 μmol/mL濃度下，對(duì)蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌的清除作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)；8 μmol/mL和16 μmol/mL的(+)-4-萜品醇對(duì)上述單一菌種菌膜的清除率分別為：蠟樣芽孢桿菌21%、51%；大腸桿菌77%、81%；銅綠假單胞菌37%、48%；阪崎腸桿菌26%、57%；金黃色葡萄球菌40%、65%；鼠傷寒沙門(mén)氏菌51%、53%；最大清除率可達(dá)到80%以上(見(jiàn)圖4中A)。

SAEW對(duì)96孔板中培養(yǎng)48 h后的蠟樣芽孢桿菌生物膜沒(méi)有明顯清除作用；但可一定程度上清除大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌的單一菌種生物膜，其清除率呈現(xiàn)出隨處理濃度先增大后減小的趨勢(shì)，在30 μg/mL具有最大清除率69%。

(+)-4-萜品醇與SAEW的協(xié)同作用見(jiàn)圖4中C和D。(+)-4-萜品醇與30 μg/mL的SAEW共同作用對(duì)單一菌種菌膜具有明顯的菌膜清除能力，其清除率約為38%～73%，低于(+)-4-萜品醇單獨(dú)作用；8 μmol/mL和16 μmol/mL的(+)-4-萜品醇在生物膜清除率上無(wú)顯著差異。(+)-4-萜品醇與SAEW協(xié)同清除蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門(mén)氏菌混菌生物被膜的作用見(jiàn)圖4中D，其清除率在SAEW濃度為30 μg/mL和(+)-4-萜品醇濃度為16 μmol/mL時(shí)達(dá)到最大62%；16 μmol/mL(+)-4-萜品醇的協(xié)同清除效果略高于8 μmol/mL。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(+)-4-萜品醇處理30 min對(duì)已形成的蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌生物膜具有顯著清除作用，其清除率隨著濃度的增加而增大；而SAEW對(duì)蠟樣芽孢桿菌生物膜的清除作用不明顯，對(duì)其他5種生物膜的清除作用在30 μg/mL最強(qiáng)；(+)-4-萜品醇的清除效果優(yōu)于SAEW。(+)-4-萜品醇與SAEW共同處理已形成的生物膜，其清除率高于SAEW單獨(dú)作用。

2.4 FESEM微觀結(jié)構(gòu)觀察

PU、PVC是食品加工中常見(jiàn)傳送材料和典型食品接觸面。采用FESEM觀察蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門(mén)氏菌混合生物膜在PU、PVC上的黏附情況，及(+)-4-萜品醇、SAEW處理菌膜微觀結(jié)構(gòu)的變化，見(jiàn)圖5。

圖5 (+)-4-萜品醇與微酸性電解水對(duì)PVC和PU表面蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門(mén)氏菌混菌生物膜微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effects of (+)-4-terpineol and SAEW on the microstructures of the mixed biofilms of B.cereus and S.typhimurium on the surfaces of PVC (A) and PU (B)

對(duì)照組見(jiàn)圖5中A(i)、B(i)，24 h培養(yǎng)后，蠟樣芽孢桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌在PVC、PU材料上形成了致密的混菌生物膜，可觀察到胞外基質(zhì)包裹的長(zhǎng)短不一的桿狀菌體細(xì)胞；PVC材料表面的生物膜中，菌體呈交疊狀排列，生物膜表面能觀察到無(wú)規(guī)、均勻排布的空隙。

30 μg/mL SAEW對(duì)PU和PVC表面的蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門(mén)氏菌混菌生物膜有明顯的清除效果，但可觀察到材料上殘余的生物膜表面形成了極致密的薄膜狀物質(zhì)包裹住大量菌體(見(jiàn)圖5中A(iii)、B(iii))，這一現(xiàn)象可能與2.3中觀察到SAEW菌膜清除率隨濃度先增大后減小的結(jié)果(見(jiàn)圖4中B)有關(guān)。8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇處理PU和PVC表面菌膜30 min后，PU和PVC表面的生物膜被大量清除，可觀察到少量稀疏的菌體聚集物黏附在表面，其清除效果優(yōu)于30 μg/mL的SAEW，見(jiàn)圖5中A(ii)、B(ii)。

(+)-4-萜品醇(8 μmol/mL)與SAEW(30 μg/mL)的聯(lián)合清除作用見(jiàn)圖5中A(iv)、B(iv)。盡管(+)-4-萜品醇與SAEW聯(lián)用對(duì)蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門(mén)氏菌混菌生物膜仍有明顯清除作用，其清除效果略優(yōu)于SAEW單獨(dú)作用，但不如(+)-4-萜品醇單獨(dú)處理組。推測(cè)SAEW處理時(shí)導(dǎo)致了未脫落細(xì)菌胞外基質(zhì)的致密化(見(jiàn)圖5中A(iii))，阻礙了(+)-4-萜品醇向生物膜內(nèi)部的進(jìn)一步滲透，細(xì)菌黏附作用增強(qiáng)，在一定程度上阻礙了生物膜的清除效果。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇與30 μg/mL的SAEW處理3 min，均能有效減少PU和PVC表面的蠟樣芽孢桿菌/鼠傷寒沙門(mén)氏菌混菌生物膜，但尚不能達(dá)到完全清除作用，在實(shí)際應(yīng)用中，可考慮與高壓水形成的機(jī)械剪切力共同作用，進(jìn)一步提高清除效果。(+)-4-萜品醇單獨(dú)處理組的效果優(yōu)于SAEW處理組，由于SAEW處理可能導(dǎo)致胞外基質(zhì)致密化形成滲透阻礙，二者的協(xié)同效果不明顯。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)(+)-4-萜品醇對(duì)蠟樣芽孢桿菌等食源性病原菌的抑菌活性、生物膜清除能力、菌膜微觀結(jié)構(gòu)及與SAEW協(xié)同作用的研究，證實(shí)(+)-4-萜品醇單體具有廣譜抑菌作用，其最低抑菌濃度為2 μmol/mL，與SAEW具有協(xié)同抑菌作用；(+)-4-萜品醇能夠快速清除蠟樣芽孢桿菌及各類(lèi)細(xì)菌生物膜，清除率可達(dá)80%以上，清除效果顯著優(yōu)于SAEW。(+)-4-萜品醇有望成為安全、高效的廣譜抗菌劑和細(xì)菌生物膜清除劑，應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。