張芳，戴毅，李洪慶*，陶文亮，許子競

(1.貴州民族大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700)

麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)是禾本竹亞科牡竹屬多年生木本植物[1]，主要分布于福建、四川、貴州和云南等地[2]。麻竹應(yīng)用廣泛，竹材可用于建筑、造紙和手工藝術(shù)品等[3]，竹筍可食用[4]，在麻竹的開發(fā)利用過程中產(chǎn)生的大量竹葉被當(dāng)作廢棄物丟棄，不僅浪費資源，而且污染環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，麻竹葉中的黃酮類化合物具有抗氧化、消炎和抑菌等作用[5-6]，竹葉黃酮類物質(zhì)作為一種功能性食品[7-8]，可作為食品添加劑廣泛應(yīng)用于保鮮劑[9-10]、飼料添加劑[11-12]及調(diào)味劑[13-14]等生產(chǎn)中。因此，對麻竹葉中黃酮類化合物進行研究具有重要理論意義。

竹葉中的黃酮類化合物主要以碳苷黃酮為主，其次為氧苷黃酮[15]；碳苷黃酮的水溶性較強，且具有較高的穩(wěn)定性，不易被酸水解，而氧苷黃酮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易被水解[16]。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，有關(guān)酸水解竹葉黃酮類化合物的研究較少，主要有：張英等[17]發(fā)現(xiàn)毛金竹竹葉中碳苷黃酮的鍵能較強，酸水解條件控制不當(dāng)會造成含量測定誤差；Guo等[18]運用HPLC-光電二極管陣列檢測器(DAD)測定筠竹竹葉提取物水解液中的化合物，利用液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜法(LC-ESI-MS)分離鑒定出葒草苷(orientin)、異葒草苷(isoorientin)、牡荊苷(vitexin)和異牡荊苷(isovitexin)等碳苷黃酮。目前，國內(nèi)外對麻竹葉黃酮類化合物的超聲波輔助酸水解工藝研究未見報道。

本文以赤水麻竹葉的提取物為研究對象，考察超聲功率、底物濃度、鹽酸濃度、時間和溫度等因素對4種碳苷黃酮含量的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酸水解工藝，為進一步開發(fā)麻竹葉資源提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及儀器

1.1.1 實驗原料

麻竹葉：由貴州赤天化紙業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)貴州民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院蘇春花副教授鑒定。

1.1.2 實驗儀器

1.1.3 實驗試劑

葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷標準品：純度>98%，成都植標化純生物技術(shù)有限公司；鹽酸、冰醋酸和甲醇：分析純，重慶川東化工有限公司；甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；超純水：實驗室自制?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品溶液配制及標準曲線繪制

精密稱取適量葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷標準品，用甲醇超聲溶解，定容至25 mL容量瓶中，得到單標對照品儲備液，見表1。

表1 4種碳苷標準品儲備液制備Table 1 The preparation of four C-glycoside standard sample stock solution

分別吸取單標儲備液，配制成一定濃度的混合對照品標準溶液(見表2)，繪制標準曲線。

表2 混合對照品標準溶液濃度Table 2 The concentration of standard solution of mixed reference sample μg/mL

1.2.2 麻竹葉提取物制備

準確稱取過60目篩的麻竹葉粉100.0 g于2000 mL燒瓶中，加入1600 mL 80%乙醇，在70 ℃下超聲(300 W)回流提取50 min，提取3次，合并提取液，減壓濃縮，除醇，冷凍干燥，得麻竹葉提取物。

1.2.3 樣品溶液制備

精確稱取一定質(zhì)量的麻竹葉提取物于25 mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成一定濃度的麻竹葉提取物樣品溶液。從中精密吸取0.5 mL于10 mL水解管中，加入3.5 mL甲醇稀釋，搖勻，再加入1 mL一定濃度的鹽酸，密封，搖勻，于超聲清洗儀中設(shè)置一定功率、時間和溫度進行水解。超聲結(jié)束后，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，用少量甲醇沖洗水解管3次，合并沖洗液與水解液，定容，過0.22 μm濾膜，得樣品溶液。

1.2.4 高效液相色譜條件

采用Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(A)-0.1%冰醋酸水溶液(B)，體積流量1.00 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長330 nm，進樣量10 μL，梯度洗脫條件見表3。

表3 流動相梯度洗脫程序Table 3 The mobile phase gradient elution program

1.2.5 單因素實驗

分別考察超聲功率(200，250，300，350，400 W)、底物濃度(0.25，0.5，1，1.5，2 mg/mL)、鹽酸濃度(0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mol/L)、時間(90，120，150，180，210 min)和溫度(55，60，65，70，75 ℃)等因素對4種碳苷黃酮含量的影響。

總含量(%)=異葒草苷含量(%)+葒草苷含量(%)+牡荊苷含量(%)+異牡荊苷含量(%)。

式中：C標為標準品混合液中某種碳苷黃酮濃度，mg/mL；S樣為樣品溶液中某種碳苷黃酮峰高，mAU；V0為稱樣后定容體積，mL；V1為取樣體積，mL；V2為取樣后定容體積，mL；S標為標準品混合液中某種碳苷黃酮峰高，mAU；M為樣品稱樣量，mg。

1.2.6 響應(yīng)面實驗

根據(jù)1.2.5中的單因素實驗結(jié)果，以4種碳苷黃酮的含量為響應(yīng)值Y，以鹽酸濃度(A)、時間(B)和溫度(C)為變量，進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，因子編碼及水平見表4。

表4 三因素和三水平設(shè)計Table 4 Three-factor and three-level design

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線線性關(guān)系

由圖1可知，在1.2.3液相色譜條件下，異葒草苷、葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷的出峰時間依次為29.50，30.75，32.78，36.58 min，具有較好的分離效果。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2。

圖1 標準品色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard sample

結(jié)果表明，相關(guān)系數(shù)均接近1，可在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)分別對4種碳苷黃酮進行定量測定。

2.2 單因素對麻竹葉提取物4種碳苷黃酮含量的影響

2.2.1 超聲功率的影響

由圖3可知，超聲功率在200～400 W范圍內(nèi)，酸水解對碳苷黃酮含量的影響不明顯，但300 W時得率最高。因此，固定超聲功率為300 W。

圖3 不同超聲功率的影響

2.2.2 底物濃度的影響

由圖4可知，底物濃度在0.25～2 mg/mL范圍內(nèi)，酸水解對碳苷黃酮含量的影響不明顯，但1 mg/mL后得率開始趨于平緩。因此，固定底物濃度為1 mg/mL。

圖4 不同底物濃度的影響Fig.4 The effect of different substrate concentration

2.2.3 鹽酸濃度的影響

由圖5可知，鹽酸濃度在0.6～1.0 mol/L的范圍內(nèi)，增加鹽酸濃度有利于提高碳苷黃酮含量，其原因可能是在水解過程中，碳苷黃酮的衍生物轉(zhuǎn)化生成4種碳苷黃酮[19]。當(dāng)鹽酸濃度超過1.0 mol/L時，碳苷黃酮含量開始下降，其原因可能是過高的鹽酸濃度加劇了黃酮結(jié)構(gòu)的破壞。因此，鹽酸濃度選擇1.0 mol/L為宜。

圖5 不同鹽酸濃度的影響Fig.5 The effect of different hydrochloric acid concentration

2.2.4 時間的影響

由圖6可知，碳苷黃酮含量隨著時間的延長呈先升后降的趨勢；時間為150 min時，總含量達到最大值，推測為水解過程基本完成；繼續(xù)延長時間，可能會更多地破壞黃酮結(jié)構(gòu)。因此，時間選擇150 min為宜。

圖6 不同時間的影響Fig.6 The effect of different time

2.2.5 溫度的影響

由圖7可知，碳苷黃酮含量隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢；當(dāng)溫度超過65 ℃時，過高的溫度有可能會加速黃酮結(jié)構(gòu)的破壞。因此，溫度選擇65 ℃為宜。

圖7 不同溫度的影響Fig.7 The effect of different temperatures

2.3 響應(yīng)面實驗優(yōu)選最優(yōu)條件

2.3.1 超聲波輔助酸水解響應(yīng)面工藝優(yōu)化

通過響應(yīng)面Design-Expert軟件進行方差分析，得到以下結(jié)果：

將上述實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，以麻竹葉提取物4種碳苷黃酮的含量(Y)為評價指標[20]，對鹽酸濃度(A)、時間(B)和溫度(C)進行二次多項式模型方程擬合得到回歸模型為：

Y=-11.45985+0.47437A+0.024779B+0.32301C-3.91667×10-3AB+0.03375AC-1.45×10-4BC-1.0575A2-3.86667×10-5B2-2.562×10-3C2。

對該模型進行顯著性方差分析，分析結(jié)果見表6。

表5 實驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 The experimental design and results

由表6可知，該模型中F值為102.34，P值<0.0001，差異極顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.9925，校正系數(shù)RAdj2=0.9828，表明實驗結(jié)果有98.28%以上受到各因素的影響；失擬項的P>0.05，差異不顯著，表明該模型可靠。

表6 回歸系數(shù)的顯著性分析Table 6 The significance analysis of regression coefficients

交互項AB、AC和BC的P值均<0.01，說明A、B和C之間交互影響較大，對4種碳苷黃酮含量的影響顯著；根據(jù)表6中F值推出3個因素的主效關(guān)系：溫度(C)>鹽酸濃度(A)>時間(B)。

對上述回歸方程進行求解，得到最優(yōu)酸水解工藝：鹽酸濃度為0.995 mol/L,時間為147.350 min和溫度為65.426 ℃，4種碳苷黃酮含量為1.168%。

2.3.2 響應(yīng)面交互因素

根據(jù)鹽酸濃度(A)、時間(B)和溫度(C)對碳苷黃酮含量的影響，做響應(yīng)曲面和等高線圖[21]，見圖8。

由圖8可知，在AB響應(yīng)面圖中，A因素的坡度較陡，對其得率的影響大于B因素[22]；同法考察 AC和BC響應(yīng)面圖，確定各因素的影響程度依次為溫度(C)>鹽酸濃度(A)>時間(B)，與方差分析結(jié)果一致。本實驗中AB、AC和BC的等高線圖呈橢圓形，各因素之間的交互作用對酸水解麻竹葉提取物的影響較顯著。

2.3.3 工藝驗證

結(jié)合實際條件，將2.3.1項下優(yōu)化的超聲波輔助酸水解工藝參數(shù)調(diào)整為：鹽酸濃度為1.0 mol/L、溫度為65 ℃和時間為147 min。按照1.2.4項色譜條件對酸水解前與酸水解后碳苷黃酮的含量進行測定，結(jié)果見表7。

表7 平行實驗結(jié)果Table 7 The results of parallel experiments %

由表7可知，驗證實驗得到的4種碳苷黃酮含量為1.157%(n=3，RSD=0.22%)，與預(yù)測值1.168%的相對誤差為0.94%，比酸水解前的4種碳苷黃酮含量高1.384倍，說明該工藝可行。

3 結(jié)論

本文在單因素實驗基礎(chǔ)上，通過固定超聲功率(300 W)和底物濃度(1 mg/mL)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了麻竹葉提取物的超聲波輔助酸水解工藝。結(jié)果表明，影響因素的主效關(guān)系為：溫度的影響最大，鹽酸濃度次之，時間的影響最小；根據(jù)實際情況調(diào)整后的工藝為：鹽酸濃度為1 mol/L、溫度為65 ℃和時間為147 min；在此條件下，得到酸水解后麻竹葉提取物4種碳苷黃酮含量平均值為1.157%，與預(yù)測值1.168%的相對誤差為0.94%，比酸水解前得率高1.384倍。在食品中添加適量的黃酮化合物可以增加食品的抗脂質(zhì)氧化性，改善其風(fēng)味及口感，提高食品性能。因此，深入開展麻竹葉提取物的研究對綜合利用麻竹葉黃酮類化合物具有一定的指導(dǎo)和應(yīng)用價值。