孫會(huì)剛,陳志軒,卞路遙，陳學(xué)紅,周中馳,李同祥

(徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018)

近年來，天然防腐劑因其高效、安全、廣譜等特點(diǎn)逐漸成為食品防腐劑領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1]，天然植物提取物更是由于含有酚類、有機(jī)酸、類黃酮類化合物，常被用來作為亞硝酸鈉功能替代品應(yīng)用到食品防腐領(lǐng)域[2]。本文對(duì)兩種徐州地區(qū)特色的食用植物進(jìn)行復(fù)配后提取活性物質(zhì)，并將其應(yīng)用于食品防腐保鮮，顯示了較好的效果。

牛蒡是菊科牛蒡?qū)僦备刀晟笮筒荼局参?，原產(chǎn)于我國(guó)，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥中的一種。牛蒡根中富含菊糖、纖維素、蛋白質(zhì)、氨基酸以及鈣、磷、鐵等人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和礦物質(zhì)，而且其具有多種生理活性，它不僅可以清除體內(nèi)垃圾，改善體循環(huán)，尤其對(duì)糖尿病、性機(jī)能減退、肥胖癥、風(fēng)濕等病癥有明顯效果[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于牛蒡活性物質(zhì)的提取、抗菌等方面的研究。牛蒡在食品方面的應(yīng)用主要是牛蒡相關(guān)保健食品的開發(fā)，如牛蒡茶、牛蒡飲料、牛蒡醬等[4]；牛蒡提取物在食品防腐保鮮方面也有報(bào)道，如方海峰等研究了牛蒡乙醇提取液對(duì)藍(lán)莓有明顯的保鮮效果[5]；賀菊萍等研究發(fā)現(xiàn)牛蒡皮提取液對(duì)豬肉中腐敗菌單增李斯特菌具有較好的抑制作用[6]；崔莉等研究證明牛蒡復(fù)合保護(hù)劑能夠提高益生菌的耐受性[7]。

苔干，又名響菜、貢菜，為植物系菊科萵苣屬莖用萵苣，是我國(guó)江蘇邳州市和安徽渦陽(yáng)縣義門鎮(zhèn)的名優(yōu)特產(chǎn)蔬菜，迄今已有兩千多年的種植歷史。苔干中含有豐富的氨基酸、果膠、多糖、黃酮類、酚類物質(zhì)以及各種無機(jī)鹽，具有健胃、利水、清熱解毒等功能，有“天然保健品”、“植物營(yíng)養(yǎng)素”之稱。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于苔干活性成分及其抑菌方面的研究[8]，根據(jù)以上研究，可以得出苔干提取物具有良好的抑菌作用，其在食品防腐保鮮方面的應(yīng)用報(bào)道較少，僅有盧臣等報(bào)道通過試驗(yàn)確定了苔干乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細(xì)菌有良好的抑制作用，對(duì)饅頭、圣女果、橘子、濕面條均有不同程度的防腐保鮮作用[9]。苔干在食品防腐保鮮方面的研究還需要更加全面、深入的開展。

本研究擬對(duì)苔干和牛蒡復(fù)配后活性物質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并研究其對(duì)抗菌活性的影響及其在食品方面的防腐保鮮作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

材料：牛蒡(burdock)：購(gòu)于徐州豐縣；苔干(dried moss)：購(gòu)于徐州邳州。

菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌)，均為實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：氯化鈉、瓊脂粉，天津市福晨化學(xué)試劑廠；胰蛋白胨、酵母浸出粉，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯，上海博微生物科技有限公司；無水乙醇，上海凱沃生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

IS-RDH2恒溫恒濕振蕩器 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；303-1電熱恒溫培養(yǎng)箱 紹興市銀河機(jī)械設(shè)備有限公司；GS-700高速多功能粉碎機(jī) 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；低溫臺(tái)式離心機(jī) 北京聯(lián)合科力科技有限公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Christ Alpha 1-2 LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛蒡苔干復(fù)配后活性物質(zhì)的提取

1.3.1.1 牛蒡與苔干的處理

牛蒡：將新鮮牛蒡根莖洗凈后切塊，用2%的檸檬酸溶液浸泡10 min，于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，用無菌袋收集，置于4 ℃冰箱中備用。

苔干：將苔干置于去離子水中進(jìn)行復(fù)水，洗凈后，放入恒溫干燥箱內(nèi)，于60 ℃烘干至恒重，用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，用無菌袋收集，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.1.2 提取液的制備

考慮到在食品防腐中的應(yīng)用，本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取法[10]，用乙醇來提取牛蒡和苔干中的抑菌活性物質(zhì)。準(zhǔn)確稱量4份10 g牛蒡粉與苔干粉，分別置于4個(gè)錐形瓶中，按料液比1∶10，再分別量取100 mL的80%乙醇和水加入錐形瓶中。充分混勻后，將4個(gè)錐形瓶放入超聲清洗器中，于室溫28 ℃下密封浸提1 h。待原料浸提完成后，將提取液進(jìn)行抽濾，并將濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中在45 ℃下濃縮至10 mL，得到原液(原液濃度為1 g/mL)。

1.3.2 牛蒡和苔干的復(fù)配

將牛蒡粉與苔干粉分別按6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8的比例混合，按上述提取液的制備方法進(jìn)行抗菌物質(zhì)的提取。

1.3.3 抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法[11]。

1.3.4 牛蒡與苔干復(fù)配提取的單因素試驗(yàn)

在提取過程中發(fā)現(xiàn)，影響牛蒡和苔干抗菌活性物質(zhì)有4個(gè)主要因素，分別是提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度及復(fù)配比。將提取溫度28 ℃、60%乙醇、料液比1∶10、牛蒡與苔干的復(fù)配比5∶5、用超聲波輔助提取且提取時(shí)間60 min設(shè)定為前提條件，每個(gè)因素選取5個(gè)變量，分別是28，45，55，65，75 ℃；20，40，60，80，100 min；水、20%、40%、60%和80%乙醇；6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)抑菌活性影響最大的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化。

1.3.5 牛蒡與苔干復(fù)配提取的正交試驗(yàn)

為綜合考慮各個(gè)因素影響的主次順序，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定影響每個(gè)因素的3個(gè)水平，按正交表L9(34)安排試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果以抑菌圈直徑大小來表示，試驗(yàn)結(jié)果需重復(fù)3次取平均值。根據(jù)極差的大小確定影響牛蒡和苔干提取工藝的主要與次要因素。

1.3.6 牛蒡與苔干提取液在食品防腐保鮮中的應(yīng)用

1.3.6.1 腐爛程度

水果、蔬菜及其他種類食品在其日常的保藏過程中腐爛、發(fā)霉的現(xiàn)象普遍存在，因此防止食品發(fā)生或者減緩其腐敗成為食品保藏運(yùn)輸中最令人關(guān)注的問題。本文中食品的腐爛程度主要以腐爛指數(shù)[12]為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體見下式：

腐爛級(jí)別：0級(jí)為無腐爛；1級(jí)為0～1/4面積腐爛；2級(jí)為1/4～1/2面積腐爛；3級(jí)為1/2～3/4面積腐爛；4級(jí)為3/4～1面積腐爛。

1.3.6.2 提取物對(duì)饅頭的防腐保鮮作用

購(gòu)買新鮮饅頭，均勻切成12塊，分為4組，每3塊為一組作為平行試驗(yàn)組。用1倍和0.5倍的提取液分別充分噴灑在分好的3組饅頭上，以噴灑無菌水和噴灑0.5%山梨酸鉀的組合作為對(duì)照組，用保鮮膜包好之后放在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察饅頭的腐敗情況。

1.3.6.3 提取物對(duì)香蕉的防腐保鮮作用

從水果店購(gòu)買香蕉，用去離子水洗凈，分為4組，每3根為一組作為平行試驗(yàn)組。用1倍和0.5倍的提取液分別充分噴灑在分好的3組香蕉上，以噴灑無菌水和0.5%山梨酸鉀的組合作為對(duì)照組，用保鮮膜包好之后放在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察香蕉的腐敗情況。

1.3.6.4 提取物對(duì)番茄的防腐保鮮作用

準(zhǔn)備8個(gè)大小一致的新鮮小番茄，分為4組，每2個(gè)為一組作為平行試驗(yàn)組。將番茄洗凈，自然晾干后，切片處理，置于培養(yǎng)皿中[13]。用1倍和0.5倍的提取液分別噴灑在分好的4組小番茄上，以噴灑無菌水和0.5%山梨酸鉀的組合作為對(duì)照組，用保鮮膜包好之后放在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)觀察番茄的腐爛情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 苔干和牛蒡復(fù)配活性物質(zhì)提取單因素優(yōu)化

2.1.1 提取溫度對(duì)復(fù)配提取物抑菌活性的影響

提取溫度對(duì)復(fù)配提取物的抑菌活性有一定影響(見圖1)，在設(shè)定的提取條件下，28～55 ℃提取物的活性逐漸升高，55～75 ℃趨于穩(wěn)定，略有下降。原因可能是隨著溫度升高，活性物質(zhì)的溶解度增加，繼續(xù)升高溫度可能對(duì)活性物質(zhì)的穩(wěn)定造成一定影響而導(dǎo)致活性下降，其最適提取溫度為55 ℃。故正交試驗(yàn)選取提取溫度為45，55，65 ℃ 3個(gè)水平。

圖1 提取溫度對(duì)復(fù)配提取物活性的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the activity of compound extract

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)復(fù)配提取物抑菌活性的影響

提取時(shí)間對(duì)復(fù)配提取物的抑菌活性有一定影響(見圖2)，在設(shè)定的提取條件下，80 min為最優(yōu)，提取時(shí)間過短，溶解不充分；時(shí)間過長(zhǎng)，影響活性物質(zhì)的穩(wěn)定性，故提取物活性會(huì)下降。故正交試驗(yàn)選取提取時(shí)間為60，80，100 min 3個(gè)水平。

圖2 提取時(shí)間對(duì)復(fù)配提取物活性的影響Fig.2 Effect of extraction time on the activity of compound extract

2.1.3 復(fù)配比對(duì)復(fù)配提取物抑菌活性的影響

復(fù)配比對(duì)復(fù)配提取物的抑菌活性有一定影響(見圖3)，牛蒡與苔干復(fù)配比為4∶6時(shí)，抑菌活性最好，而牛蒡與苔干復(fù)配比為3∶7、2∶8時(shí)，抑菌活性較低，所以選擇復(fù)配比為6∶4、5∶5、4∶6 3個(gè)水平進(jìn)行下一步的正交試驗(yàn)。

圖3 復(fù)配比對(duì)復(fù)配提取物活性的影響Fig.3 Effect of compound ratio on the activity of compound extract

2.1.4 乙醇濃度對(duì)復(fù)配提取物抑菌活性的影響

乙醇濃度對(duì)復(fù)配提取物的抑菌活性有較大的影響(見圖4)，當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，復(fù)配提取物的抑菌活性最高，當(dāng)乙醇濃度為95%時(shí)提取率最低，因此選取乙醇濃度為20%、40%、60% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。

圖4 乙醇濃度對(duì)復(fù)配提取物活性的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the activity of compound extract

2.2 苔干和牛蒡復(fù)配活性物質(zhì)提取正交試驗(yàn)

由表1～表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，以對(duì)食品常見腐敗菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性為考察指標(biāo)，均為試驗(yàn)7 A3B1C3D2為最佳復(fù)配物提取條件，即提取溫度為65 ℃，提取時(shí)間為60 min，復(fù)配比為4∶6，乙醇濃度為40%。

表1 復(fù)配提取物對(duì)大腸桿菌抑菌活性的正交試驗(yàn)Table 1 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Escherichia coli

表2 復(fù)配提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性的正交試驗(yàn)Table 2 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Staphylococcus aureu

表3 復(fù)配提取物對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑菌活性的正交試驗(yàn)Table 3 Orthogonal test of antibacterial activity of compound extract against Bacillus cereus

2.3 抑菌試驗(yàn)

按照上述抑菌試驗(yàn)方法，對(duì)牛蒡、苔干、牛蒡苔干復(fù)配提取物優(yōu)化前、牛蒡苔干復(fù)配提取物優(yōu)化后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)復(fù)配優(yōu)化后提取物的抑菌活性比牛蒡、苔干單獨(dú)的提取物及復(fù)配優(yōu)化前的提取物抑菌活性都要好(見圖5)。同時(shí)本試驗(yàn)也比較了牛蒡、苔干的水提取物，發(fā)現(xiàn)兩者的乙醇提取物比水提取物的抑菌活性更好(見圖6)，所以復(fù)配后選取進(jìn)行乙醇提取并優(yōu)化。

圖5 復(fù)配比對(duì)復(fù)配提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of compound ratio on antibacterial activity of compound extract

圖6 優(yōu)化后的提取物與牛蒡、苔干單獨(dú)提取物抑菌活性比較Fig.6 Comparison of the antibacterial activity of the optimized extract and extract of burdock and dried moss alone

2.4 復(fù)配提取活性物質(zhì)防腐保鮮作用

2.4.1 腐爛程度

根據(jù)上述方法考察復(fù)配提取液對(duì)鮮切番茄、香蕉、饅頭腐爛指數(shù)的影響。以無菌水和0.5%山梨酸鉀作為對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)配提取物對(duì)3種食品均有一定的防腐作用，且對(duì)饅頭的防腐效果最好，且1倍的提取液對(duì)香蕉的防腐效果比0.5倍的提取液明顯更好，見表4。

表4 復(fù)配提取物對(duì)番茄、香蕉、饅頭腐爛指數(shù)的影響Table 4 Effects of compound extract on decay indexes of tomato, banana and steamed bread

2.4.2 鮮切番茄保藏過程的表觀評(píng)定

由圖7可知，復(fù)配提取液的0.5倍、1倍以及0.5%的山梨酸鉀對(duì)鮮切番茄的防腐保鮮效果均比無菌水好。無菌水噴灑過的鮮切番茄出現(xiàn)大面積發(fā)霉變質(zhì)，0.5%山梨酸鉀對(duì)鮮切番茄的保鮮效果較好，而經(jīng)過提取液噴灑后的鮮切番茄僅有少面積發(fā)霉變質(zhì)，有效地延遲了腐敗時(shí)間。

圖7 復(fù)配提取物對(duì)鮮切番茄的防腐試驗(yàn)Fig.7 Preservation test of compound extract on fresh-cut tomato

2.4.3 香蕉保藏過程的表觀評(píng)定

由圖8可知，噴灑無菌水的香蕉出現(xiàn)了大面積的黑色斑點(diǎn)，香蕉的果肉出現(xiàn)輕微黑色，而噴灑了1倍復(fù)配提取液的香蕉防腐狀態(tài)較好，防腐效果其次是0.5%的山梨酸鉀與0.5倍的提取液。

圖8 復(fù)配提取物對(duì)香蕉的防腐試驗(yàn)Fig.8 Preservation test of compound extract on banana

2.4.4 饅頭保藏過程的表觀評(píng)定

對(duì)于饅頭的防腐效果(見圖9)，1倍復(fù)配提取液對(duì)饅頭的防腐效果最佳，無明顯腐敗現(xiàn)象，其次防腐效果為山梨酸鉀溶液，而無菌水的腐敗情況最嚴(yán)重且大面積發(fā)霉。

圖9 復(fù)配提取物對(duì)饅頭的防腐試驗(yàn)Fig.9 Preservation test of compound extract on steamed bread

3 結(jié)語

植物源天然防腐劑應(yīng)用于食品防腐保鮮的研究很多，如洪軍等研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮提取物對(duì)5種食源性致病菌具有很好的抑菌作用，并可將冷卻雞肉的保鮮延長(zhǎng)至10 d左右[14]；閆佳佳等研究了漢麻葉黃酮成分及其抑菌活性，發(fā)現(xiàn)該植物成分對(duì)3種食源性致病菌的抑菌效果較為明顯[15]。天然防腐劑因其安全性和抑菌廣譜性，在調(diào)味品防腐保鮮方面也具有較大的應(yīng)用潛力，如李惠等研究發(fā)現(xiàn)微生物源天然防腐保鮮劑Nisin顯著抑制番茄醬菌落總數(shù)的增加[16]；郭俊華制備的復(fù)合調(diào)味品姜醬使用了植物源的有效成分R-多糖和植酸，取得了較好的防腐保鮮效果[17]；孫瑩用丁香和桂皮作為復(fù)配防腐劑將低鹽醬加工成具有良好防腐保鮮效果的調(diào)味低鹽醬[18]。本研究用到的材料牛蒡和苔干提取物應(yīng)用于食品防腐保鮮方面的研究較少，對(duì)牛蒡和苔干兩種植物材料進(jìn)行復(fù)配后提取活性物質(zhì)也屬首次，對(duì)于植物源天然防腐劑的開發(fā)具有一定的借鑒價(jià)值。

牛蒡和苔干都能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，本文采用復(fù)配的方法提取其中的活性物質(zhì)，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化其活性物質(zhì)提取工藝，獲得了最優(yōu)的提取方案。通過抑菌試驗(yàn)證明，復(fù)配后其抑菌活性比牛蒡、苔干單獨(dú)提取物的抑菌活性明顯增強(qiáng)。用無菌水和0.5%山梨酸鉀作為對(duì)照驗(yàn)證牛蒡、苔干復(fù)配提取物在食品中的防腐作用，結(jié)果顯示其具有較好的防腐保鮮效果。且牛蒡、苔干又含有大量的活性成分，用其復(fù)配物作為防腐保鮮劑添加到食品中又具有一定的保健功能，對(duì)于新型功能性食品的開發(fā)提供了一個(gè)新的思路。