徐欣靖，皮杰，2，李德亮，劉新華，向建國，余建波*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415100）

湖泊生態(tài)系統(tǒng)是地球上重要的生態(tài)系統(tǒng)之一，它既有蓄水、凈化環(huán)境的作用，同時也具有保護水生生物多樣性的作用。湖泊水生生物資源主要包括浮游生物、魚類以及底棲生物等，它們共同組成湖泊的生物系統(tǒng)。進行湖泊水生生物多樣性調(diào)查能夠更好地了解湖泊物種組成，對生物多樣性進行監(jiān)測。但近年來，由于水利工程建設(shè)、水環(huán)境污染、棲息地被破壞、生物入侵等，引發(fā)湖泊生物資源面臨物種滅絕、群體遺傳多樣性降低等問題，進而導(dǎo)致生物資源保護面臨嚴峻挑戰(zhàn)，因此對湖泊生物資源進行調(diào)查顯得尤為重要。

水環(huán)境中生物種類組成復(fù)雜，有些種類個體微小、數(shù)量較少、不同生長階段個體差異大，在進行調(diào)查時難以捕獲、鑒定，這給湖泊資源調(diào)查工作帶來諸多困難。在傳統(tǒng)調(diào)查方法中，浮游生物是利用浮游生物網(wǎng)采集、濃縮、鑒定；魚類是利用網(wǎng)捕、誘捕、聲吶、實地調(diào)研；底棲生物則采用采泥器、底拖網(wǎng)等方法來調(diào)查。這些方法不僅費時費力、鑒別準確率低、操作煩瑣，而且高度依賴鑒定人員專業(yè)知識水平。生物在自然水域環(huán)境中活動時，從黏液、皮膚、凋亡細胞等脫落的脫氧核糖核酸（DNA）片段散落于自然環(huán)境中（如：水、空氣、土壤、冰）的DNA總和稱為該自然環(huán)境中生物的環(huán)境DNA。環(huán)境DNA（eDNA）調(diào)查方法作為一種特異性強、靈敏度高、環(huán)境友好的資源調(diào)查技術(shù)，能夠準確獲取生物物種信息，對特定物種進行監(jiān)測，可彌補傳統(tǒng)調(diào)查方法的缺陷。eDNA技術(shù)是指從環(huán)境樣品中直接提取DNA片段，并對其進行擴增、高通量測序，從而獲得樣品中多個物種信息的技術(shù)。目前eDNA技術(shù)在湖泊生物多樣性檢測、群落分布、資源評估方面都有相關(guān)的應(yīng)用。現(xiàn)通過對eDNA技術(shù)的研究背景、在湖泊生物資源調(diào)查中的應(yīng)用及對該技術(shù)的展望進行綜述，旨在為后續(xù)開展的研究工作提供一定參考。

1 eDNA技術(shù)的研究背景

eDNA技術(shù)的初探可以追溯到20世紀末。1987年，Ogram等成功從海洋泥沼中提取出微生物DNA。20世紀末科學(xué)家通過采集鯨魚糞便來鑒別種類，為eDNA技術(shù)在水域調(diào)查中的應(yīng)用提供了靈感。2005年eDNA技術(shù)首次運用到水環(huán)境領(lǐng)域，通過特異性引物擴增出源自人及家畜的線粒體DNA，測試潛在的糞便污染。2008年Ficetoal等利用美國牛蛙基因特異性引物擴增其入侵水域eDNA，發(fā)現(xiàn)牛蛙入侵的量僅有1~2只/km，這是首次直接證明eDNA技術(shù)在水域環(huán)境檢測中可行。2012年后，研究者逐漸嘗試將eDNA技術(shù)應(yīng)用于監(jiān)測特定水域生物，這也使eDNA技術(shù)在水域環(huán)境物種從定性轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬Χ?，從單一物種的檢測發(fā)展到多物種檢測和特定物種檢測，從僅為淡水檢測延伸到海水檢測，檢測的目標種群也由低等過渡到高等，測序方式也從第一代的桑格測序向第三代高通量測序轉(zhuǎn)變。自2015年后，由于eDNA研究的不斷發(fā)展，逐漸成為生態(tài)環(huán)境研究領(lǐng)域的熱點，研究領(lǐng)域也從水域eDNA向土壤eDNA、糞便eDNA等多元化發(fā)展；調(diào)查對象由魚類轉(zhuǎn)向浮游生物、底棲生物等；調(diào)查目的從物種調(diào)查向多樣性、生物量豐度調(diào)查拓展。

2 eDNA技術(shù)在湖泊生物資源研究中的應(yīng)用

目前，eDNA技術(shù)在湖泊生物資源研究中的應(yīng)用主要分為物種監(jiān)測、多樣性監(jiān)測和生物量評估3個方面，應(yīng)用于浮游生物和底棲生物的研究主要集中在物種檢測，在魚類物種檢測及多樣性監(jiān)測中應(yīng)用相對成熟，見表1。

表1 國內(nèi)eDNA技術(shù)在湖泊生物資源調(diào)查中的應(yīng)用

續(xù)表

2.1 物種監(jiān)測

eDNA技術(shù)現(xiàn)已經(jīng)應(yīng)用在湖泊物種調(diào)查、入侵種的監(jiān)測、瀕危種及稀有物種的保護中。生物入侵不僅對本地物種產(chǎn)生一定的威脅，而且還會對入侵地的生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生損傷，造成生態(tài)系統(tǒng)退化、物種流失，因此有必要對入侵種進行監(jiān)測。目前已報道的湖泊生物有浮游動植物、鯉、河鱸、克氏原螯蝦、淡水珍珠貽貝等，其中，最早是2008年Ficetola等選用牛蛙基因上的小片段合成特異性引物，并且成功在湖泊中檢測到該物種的存在，隨后利用eDNA技術(shù)監(jiān)測入侵種的工作逐漸展開。與國外相比，我國eDNA技術(shù)起步較晚，2005年有針對土壤eDNA的提取和純化方法方面的研究報道；2014年王曉輝等針對海洋底泥中的eDNA的提取和純化方法進行試驗探究，為之后eDNA技術(shù)在水域物種監(jiān)測中的成功應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。目前eDNA技術(shù)應(yīng)用于浮游生物及底棲生物調(diào)查的報道較少，有關(guān)于江豚、鱘等少數(shù)特定物種監(jiān)測的應(yīng)用報道。由于湖泊水域生態(tài)環(huán)境與生物的特異性，造成許多物種無法利用傳統(tǒng)方法進行調(diào)查，尤其是瀕危種與本地稀有種。傳統(tǒng)方法調(diào)查速度慢、準確率低、調(diào)查結(jié)果無法及時獲取，導(dǎo)致后續(xù)保護工作無法及時展開。eDNA技術(shù)的出現(xiàn)很好地彌補了傳統(tǒng)方法的不足，并對調(diào)查物種與環(huán)境十分友好，通過采集水樣對水體中含有的eDNA進行提取擴增數(shù)據(jù)分析及時獲得調(diào)查水域的物種信息、分布、豐度。這項技術(shù)最初是在一些小型淡水湖泊中得到應(yīng)用，而后逐漸向海陸不同生境不斷擴展。近年來對瀕危物種的研究主要集中在丹麥瀕臨滅絕的淡水歐洲氣象泥鰍、哥倫比亞河上游的瀕危大鱗大麻哈魚、澳大利亞的瀕危淡水魚、切薩皮克灣的河鯡等，其中海洋生物褐背蝠鲼的發(fā)現(xiàn)是eDNA技術(shù)運用于海洋的一個成功案例。由于生態(tài)系統(tǒng)地理環(huán)境極其復(fù)雜，使用eDNA技術(shù)對瀕危、稀有物種進行調(diào)查，降低了搜索難度，在一定程度上提高了檢測效率和準確率。

2.2 多樣性監(jiān)測

由于人類過度捕撈、生境的變化和外來種的入侵，導(dǎo)致調(diào)查湖泊水域生物多樣性組成發(fā)生變化，雖已采取相應(yīng)措施，但成效并不顯著。傳統(tǒng)潛水、聲吶、拖網(wǎng)操作難耗時長，因而eDNA技術(shù)的成功引入，為研究生物多樣性的變化提供一個更加快速準確的方法。同時研究人員開始將該項技術(shù)運用于一些地形復(fù)雜、難以利用傳統(tǒng)方法采樣的區(qū)域中。

魚類作為脊椎動物眾多類群中種類最多的物種，是對湖泊水域生態(tài)調(diào)查的重要生物指標。2012年，Thomsen等在丹麥溫帶海洋生態(tài)系統(tǒng)中采用eDNA技術(shù)開展海水樣品中魚類多樣性的研究，并將其與傳統(tǒng)的浮潛、拖網(wǎng)和圍網(wǎng)等調(diào)查方式進行對比，發(fā)現(xiàn)由于海洋環(huán)境地形的影響以及專業(yè)知識的限制，eDNA監(jiān)測分析結(jié)果比傳統(tǒng)鑒定方式更為客觀和可靠。此后，研究者開始對eDNA技術(shù)在分析水域生物多樣性的影響因素方面進行探索，并從海水水域研究不斷向淡水湖泊、河流區(qū)域拓展，將其投入到實踐中應(yīng)用。2018年，Ana?¨s等基于的eDNA宏條形碼開展了一次大規(guī)模的北極生物監(jiān)測，共檢測出181個物種；分析eDNA在水柱深度、潮汐池和季節(jié)方面的時空分布，提出，eDNA采樣需要考慮時空維度方面因素才能準確評估群落結(jié)構(gòu)的變化。這又一次證明eDNA技術(shù)在水生生物多樣性調(diào)查應(yīng)用中的可行性。

2.3 生物量評估

對目標生物資源的豐度調(diào)查是對水生生物資源監(jiān)控的重要內(nèi)容，通過對原始環(huán)境中eDNA濃度進行測定并比對，可探究該調(diào)查區(qū)域目標生物的生物量高低。近年來，不斷有專家對各地的物種密度進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)物種的密度與其eDNA濃度之間存在線性關(guān)系，即可以通過某物種eDNA的含量來估算其生物量。常見驗證方法是對人工養(yǎng)殖試驗區(qū)的固定物種進行密度計算，而后對該區(qū)域eDNA濃度進行測定后繪制密度-濃度曲線。但是該方法適用范圍較窄，僅限于水樣中eDNA濃度與該物種數(shù)量的相關(guān)性較強的物種，對于帶有堅硬外殼的蝦、貝類，其eDNA濃度與生物量之間的關(guān)系并不明顯。在通過eDNA濃度對生物量調(diào)查的同時，也可以對物種的遺傳多樣性進行相應(yīng)分析，來判斷物種的數(shù)量及結(jié)構(gòu)差異，進而對物種的優(yōu)良性狀是否穩(wěn)定遺傳提供參考。

3 存在的問題及展望

3.1 采集水樣后的處理與保存

由于生物釋放到水體中的DNA會受到水環(huán)境的變化被降解，導(dǎo)致提取的DNA含量少，水樣處理與保存不當會直接影響后驗結(jié)果。2014年Matthew等針對eDNA研究現(xiàn)狀的文獻進行檢索，并且使用SYBR-Green定量PCR方法對鯉eDNA降解的環(huán)境因素進行探究，發(fā)現(xiàn)eDNA降解的速度與生化需氧量、葉綠素和水環(huán)境總的eDNA濃度呈現(xiàn)負相關(guān)。另外，影響eDNA降解的非生物因素有紫外線輻射、溫度、pH值、溶解氧、鹽度和沉積物等，這也導(dǎo)致同批水樣的質(zhì)量有所不同。常見水樣處理方式有2種，分別為采樣過程中在線抽濾與冷藏保存采集的樣品帶回實驗室抽濾；保存方式為-20、-80℃、無水乙醇浸泡等。目前已有針對延長DNA保存時間的相應(yīng)研究，但關(guān)于如何避免污染、提升提取技術(shù)、選擇更好的濾膜材料的研究相對較少。

3.2 eDNA擴增引物的選擇

目前針對水生動物研究最常擴增的是、16SrDNA、RHO、等區(qū)域基因，但因生境、種類不同，同一種引物擴增出來的效果也不同。葛玉雙等針對eDNA現(xiàn)有技術(shù)方法在水生生物多樣性調(diào)查中的應(yīng)用進行研究，得出目前有2種類型引物，一種是用于檢測物種的特異性引物，另一種是用于生物多樣性評估的通用引物。設(shè)計引物一般分為2步：一為獲取目標物種的DNA序列，二為根據(jù)調(diào)查目的的不同設(shè)計引物。在未來針對特定物種進行引物開發(fā)，將對eDNA技術(shù)的推廣提供很大幫助。

3.3 選擇對比序列的基因庫

目前常用的基因庫有NCBI、BLOD和Mito chondrial Genome Database of Fish等大型開放數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫既包含淡水魚種類，也包含了海水魚種類。在對比采集淡水水體提取的eDNA時，可能由于操作或引物選擇的問題會對比出海水生物種類。對淡水湖泊中魚類種類鑒定最準確的方法，是根據(jù)當?shù)佤~類志、其他文獻記載以及采集當?shù)噩F(xiàn)有已知魚類樣本，對樣本DNA提取，建立本地魚類數(shù)據(jù)庫，再進行魚類多樣性調(diào)查，以獲得準確的調(diào)查數(shù)據(jù)。

國內(nèi)使用eDNA技術(shù)調(diào)查湖泊生物資源的研究相對國外較少，僅限于對長江、黃河、舟山近海等流域，以及洱海、太湖、鄱陽湖等部分湖區(qū)的水生生物進行了調(diào)查，研究對象涉及浮游動物、魚類、底棲生物等。雖然自2019年以來國內(nèi)針對湖泊水域生態(tài)eDNA的研究明顯增多，但由于我國幅員遼闊、地形復(fù)雜，導(dǎo)致利用傳統(tǒng)方法進行全面水生生物資源調(diào)查難度極大，新型eDNA方法能夠很好地彌補傳統(tǒng)方法缺陷，將來該項技術(shù)會應(yīng)用于更多的湖泊調(diào)查中。

在各種實際應(yīng)用中，對于特定水域利用eDNA技術(shù)進行物種調(diào)查的特有方法建立還有待提升。在生物量評估中，該方法具有廣闊的發(fā)展前景，但目前生物量的評估僅能夠從序列的OTU豐度情況來進行相應(yīng)推斷，雖然可以使用熒光定量PCR對特定基因進行定量，但針對物種的絕對豐度及生物量僅能預(yù)測，不能準確評估?，F(xiàn)已有學(xué)者將生物體及基因庫的大小納入影響因子的分析中，如何將該技術(shù)在湖泊水生生物調(diào)查中進行更好的應(yīng)用是未來研究的主要方向。