張建軍 蔡龍俊 蔡維奇

1.江蘇師范大學(xué)科文學(xué)院，江蘇徐州 221132；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院暨南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷醫(yī)院泌尿外科，江蘇宿遷 223800

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤[1]。近年來，膀胱癌的發(fā)病率和病死率呈上升態(tài)勢[2-3]。在中國，膀胱癌仍是發(fā)病率最高的泌尿生殖系腫瘤[3-5]。以溶瘤病毒為基礎(chǔ)的免疫治療近期在膀胱癌治療中取得了較大的進(jìn)展[6-7]。

黑色素瘤相關(guān)抗原A10（melanoma-associated antigen A10，MAGE-A10）是一種腫瘤相關(guān)抗原，可作為膀胱腫瘤特異性免疫治療的新靶點(diǎn)[8]。人β 防御素2（human beta defensin 2，hβD-2）被認(rèn)為是人體內(nèi)環(huán)境對(duì)外來病原微生物免疫的第一道防線[9]。應(yīng)用hβD-2的基因治療能夠介導(dǎo)抗腫瘤免疫，發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。溶瘤病毒SG502 對(duì)膀胱癌具有較高靶向性的，其加載了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）啟動(dòng)子和缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainducible factor 1，HIF-1）啟動(dòng)子[11]。在溶瘤病毒SG502的基礎(chǔ)上，本課題組應(yīng)用PCR 技術(shù)將MAGE-A10 和hβD-2 基因片段成功連接到質(zhì)粒pSG502 中，并將獲得的特異性溶瘤腺病毒命名為SG502-MAGE-A10-hβD-2。

本研究擬探究SG502-MAGE-A10-hβD-2 對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人膀胱癌細(xì)胞系T24、鼠膀胱癌細(xì)胞系MB49、人黑色素瘤細(xì)胞系LiBr 及人胚腎細(xì)胞系HEK293 購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。6～7 周齡清潔級(jí)C57BL/6 雄性小鼠購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，體重18～22 g，許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，合格證號(hào)：1107262011002579。本課題動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理中心批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：xz2020050903L）。

1.2 主要試劑及儀器

溶瘤病毒SG502 及質(zhì)粒pSG502 購自上海肝膽外科醫(yī)院病毒與基因治療中心。質(zhì)粒pUC57（B522201）、病毒骨架質(zhì)粒pPE3（B6100016）、膠回收試劑盒（SK8131）、質(zhì)粒小樣提取試劑盒（B519196-0010）購自上海生物工程公司。DNA 連接酶（2011A）、限制性內(nèi)切酶（1068A）購自TaKaRa 公司。CCK-8 試劑盒（MA0218）購自大連美侖生物公司。hβD-2 抗體購自Abcam 公司（ab243124）、MAGE-A10 抗體購自Abnova 公司（PAB4741）。Ki67 抗體（GB11030）、β-actin 抗 體（GB11001）、HRP DAB 染色試劑盒（GB1212）購自武漢谷歌生物科技公司，小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，Ek-M21257）、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ，Ek-M2014）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自美國Bioscience 公司。

PCR 儀（北京東勝科技公司，東勝龍ETC811），電泳儀及電泳裝置（北京六一儀器廠，DYY-6型及DYCP-31DN）、酶標(biāo)儀（TECAN 公司，infinite 200）、電泳跑膠系統(tǒng)（伯樂公司，1658033）、電子天平（花潮高科公司，精度0.1 mg，F(xiàn)A2004G）.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物飼養(yǎng)

將LiBr 及HEK293 細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS 及青、鏈霉素的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液中，T24、MB49 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS 及青、鏈霉素的RMPI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。C57BL/6 小鼠分籠飼養(yǎng)于清潔級(jí)條件下的層流架中，飼養(yǎng)條件25～28℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.4 溶瘤腺病毒SG502-MAGE-A10-hβD-2 的構(gòu)建及鑒定

從LiBr 細(xì)胞中提取總RNA；根據(jù)MAGE-A10 基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)引物（P1：5’-ACACTCCCACCTGCTACCC-3’，P2：5’-CATGTGGTATTTGACTTGCCT-3’），行PCR 擴(kuò)增后，得到大小約1260 bp DNA 片段。用EcoRV 酶切pUC57 質(zhì)粒，將目的基因的PCR 產(chǎn)物與pUC57 載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到pUC57-MAGEA10 質(zhì)粒。從膀胱組織中提取總RNA；根據(jù)hβD-2 基因序列設(shè)計(jì)1 對(duì)引物（P1：5’-TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCATP -3’，P2：5’ -TGGACACCATAGTTTAA -TTTGG-3’），行PCR 擴(kuò)增后，得到大小約311 bp DNA片段。用EcoRV 酶切pUC57 質(zhì)粒，將目的基因的PCR 產(chǎn)物與pUC57 載體酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到pUC57-hβD-2 質(zhì)粒。分別提取質(zhì)粒電泳及雙酶切鑒定，并由安徽通用系統(tǒng)有限公司測序確認(rèn)插入產(chǎn)物。

應(yīng)用PCR 技術(shù)將引入SpeⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的MAGE-A10 和hβD-2 基因片段連接到經(jīng)SpeⅠ和SalⅠ雙酶切后的質(zhì)粒pSG502 中，將鑒定正確的特異性溶瘤病毒載體命名為PSG502-MAGE-A10-hβD-2。

將特異性溶瘤病毒載體PSG502-MAGE-A10-hβD-2 與病毒骨架質(zhì)粒pPE3 共轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染后9～14 d 出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過3 次病毒空斑純化，提取溶瘤病毒DNA，應(yīng)用PCR 進(jìn)行鑒定，經(jīng)鑒定正確的溶瘤病毒命名為SG502-MAGE-A10-hβD-2。反復(fù)擴(kuò)增至需要病毒量，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖

取96 孔板，將對(duì)數(shù)生長期的T24、MB49 細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種，每孔100 μl，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。SG502組加入SG502 病毒（MOI 為10），SG502-MAGE-A10-hβD-2 組加入SG502-MAGE-A10-hβD-2 病毒（MOI為10），對(duì)照組加入PBS，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。加入CCK-8 試劑后用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞成活率。細(xì)胞成活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 溶瘤病毒對(duì)鼠膀胱癌腫瘤的作用

C57BL/6 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，PBS 將用胰蛋白酶消化下來的MB49 細(xì)胞制成濃度為1.5×107/ml細(xì)胞懸液，取0.2 ml 細(xì)胞懸液注射到每只小鼠的左前肢腋窩皮下，待腫瘤生長至100～150 mm3后將成瘤后的18 只C57BL/6 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分成對(duì)照組、SG502 組及SG502-MAGE-A10-hβD-2 組，每組各6 只。對(duì)照組、SG502 組、SG502-MAGE-A10-hβD-2 組每周2 次分別給予50 μl 生理鹽水、含有2×108個(gè)病毒顆粒數(shù)的SG502 病毒的50 μl 生理鹽水溶液、含有2×108個(gè)病毒顆粒數(shù)的SG502-MAGE-A10-hβD-2 病毒的50 μl 生理鹽水溶液進(jìn)行瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，連續(xù)5 周，測量成瘤體積以觀察各組荷瘤小鼠腫瘤生長曲線。

1.7 ELISA 檢測小鼠血清TNF-α 及IFN-γ 水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 d 后，脫頸處死小鼠，摘除眼球法取血，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測小鼠血清TNF-α及IFN-γ。取出瘤體組織，剝離纖維包膜后在電子天平上稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-藥物組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量）×100%。

1.8 Western blot 檢測MAGE-A10 及hβD-2 蛋白的表達(dá)

腫瘤組織PBS 洗凈，每20 毫克組織加入200 μl蛋白裂解液，在酶標(biāo)儀上，用BCA 試劑盒檢測并計(jì)算出各組蛋白的濃度，采用SDS-PAGE 電泳的方法轉(zhuǎn)膜?？焖俜忾]液常溫封閉10 min，4℃條件下用MAGEA10（1∶1000）及hβD-2（1∶1000）一抗孵育過夜；再經(jīng)山羊抗兔二抗（1∶5000）常溫條件孵育1 h，ECL 顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中拍攝照片，并分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.9 小鼠成瘤組織Ki67 的免疫組化檢測

將石蠟包埋的對(duì)照組、SG502 組、SG502-MAGEA10-hβD-2 組腫瘤樣品進(jìn)行脫蠟，然后在過氧化氫中孵育以阻斷辣根過氧化物酶。在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原回收后山羊血清封閉，在4℃下將切片用一抗Ki67（1∶300）孵育過夜，孵育山羊抗兔二抗（1∶200），DAB 染色液顯色，將切片用蘇木精復(fù)染。將待測樣本在400 倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，利用Image J 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，分別進(jìn)行平均OD 值測定，計(jì)算其均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較在方差齊時(shí)采用One-way ANOVA 分析，方差不齊時(shí)應(yīng)用非參數(shù)檢驗(yàn)。重復(fù)測量資料應(yīng)用重復(fù)測量資料方差分析，并進(jìn)行球形檢驗(yàn)，若不符合球形檢驗(yàn)則結(jié)果進(jìn)行Greenhouse-Geisser 校正。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溶瘤病毒克隆的鑒定及病毒滴度的測定

PCR 鑒定結(jié)果見圖1，溶瘤病毒SG502-MAGEA10-hβD-2 擴(kuò)增出約311 及1260 bp 的特異性片段，而陰性對(duì)照（ddH2O）未擴(kuò)增出片段，提示所得的病毒即為攜帶MAGE-A10 及hβD-2 基因的溶瘤腺病毒SG502-MAGE-A10-hβD-2。應(yīng)用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法測得純化后病毒滴度為2.05×1010PFU/ml。

圖1 溶瘤病毒的PCR 鑒定（n=3）

2.2 各組對(duì)T24 及MB49 細(xì)胞增殖的影響

整體分析發(fā)現(xiàn)：SG502 組T24 及MB49 細(xì)胞抑制率與對(duì)照組組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。提示SG502 病毒可抑制T24 及MB49 細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：SG502 組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的T24 及MB49 細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；組間比較：SG502組與對(duì)照組24、48、72、96h的T24及MB49細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。整體分析發(fā)現(xiàn)：SG502-MAGE-A10-hβD-2 組T24及MB49 細(xì)胞抑制率與SG502 組組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。提示SG502-MAGE-A10-hβD-2 病毒可抑制T24 及MB49細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：SG502-MAGE-A10-hβD-2 組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的T24 及MB49細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；組間比較：SG502-MAGE-A10-hβD-2 組與SG502 組24、48、72、96 h 的T24 及MB49 細(xì)胞抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 各組對(duì)T24 及MB49 增殖的影響（n=3）

2.3 各組MB49 成瘤小鼠腫瘤生長比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：SG502 組腫瘤體積與對(duì)照組組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。提示SG502 病毒病毒可抑制MB49 成瘤小鼠腫瘤生長。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：SG502 組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；組間比較：SG502 組與對(duì)照組14、21、28、35、42 d 的腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。整體分析發(fā)現(xiàn)：SG502-MAGE-A10-hβD-2 組腫瘤體積與SG502 組組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。提示SG502-MAGE-A10-hβD-2 病毒可抑制MB49 成瘤小鼠腫瘤生長。進(jìn)一步兩兩比較，組內(nèi)比較：SG502-MAGEA10-hβD-2 組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；組間比較：SG502-MAGEA10-hβD-2 組與SG502 組14、21、28、35、42 d 的腫瘤體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3A。SG502 組及SG502-MAGE-A10-hβD-2 組腫瘤生長較對(duì)照組均受到抑制，SG502 組抑瘤率為35.33%，SG502-MAGE-A10-hβD-2 組抑瘤率為46.59%。SG502 組腫瘤重量均小于對(duì)照組，SG502-MAGEA10-hβD-2 組腫瘤重量均小于SG502組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖3B。

圖3 各組MB49 成瘤小鼠腫瘤生長比較（n=6）

2.4 各組MB49 成瘤小鼠血清TNF-α、IFN-γ 水平比較

SG502 組TNF-α、IFN-γ水平均高于對(duì)照組，SG502-MAGE-A10-hβD-2 組TNF-α、IFN-γ 水平高于SG502 組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖4。

圖4 各組MB49 成瘤小鼠血清TNF-α、IFN-γ 水平比較（n=6）

2.5 各組成瘤小鼠腫瘤中MAGE-A10 及hβD-2 的蛋白表達(dá)

各組成瘤小鼠干預(yù)5 周后，SG502-MAGE-A10-hβD-2 組小鼠腫瘤中有MAGE-A10 及hβD-2 蛋白表達(dá)，而對(duì)照組和SG502 組小鼠中未見MAGE-A10及hβD-2 蛋白表達(dá)。見圖5。

圖5 各組小鼠腫瘤中MAGE-A10 及hβD-2 蛋白表達(dá)情況

2.6 各組腫瘤組織Ki67 表達(dá)情況比較

SG502 組及SG502-MAGE-A10-hβD-2 組腫瘤組織中的Ki67 表達(dá)低于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖6。

圖6 各組腫瘤組織Ki67 表達(dá)情況比較（n=6）

3 討論

溶瘤病毒治療腫瘤可特異性地感染并殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞不會(huì)造成過多的傷害[12-13]。目前全球已有160 多種溶瘤病毒正在進(jìn)行臨床前研究及臨床試驗(yàn)[14]，而在中國，有5 項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行[15]。溶瘤病毒擁有三大“殺手锏”，即直接溶瘤、打破免疫耐受和表達(dá)調(diào)控基因[6]。帶有特異性啟動(dòng)子的溶瘤病毒因具有一定的腫瘤靶向性、多種抗腫瘤機(jī)制等優(yōu)勢，在膀胱癌研究中受到廣泛的關(guān)注。溶瘤病毒CG0070已經(jīng)用于膀胱癌的治療，并且取得了一定的效果[7]。溶瘤病毒SG502-SEA 對(duì)小鼠膀胱癌腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用[16-17]。

MAGE-A10 是腫瘤和睪丸抗原（cancer-testis，CT）家族的一個(gè)成員，在黑色素瘤、膀胱癌和肺癌中有陽性表達(dá)[18]。其在非肌層浸潤性膀胱癌陽性表達(dá)中與腫瘤的分級(jí)呈正相關(guān)[8]。本課題組前期的研究表明：MAGE-A10 陽性表達(dá)的非肌層浸潤性膀胱癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)率更高，預(yù)后更差[19]。hβD-2 被認(rèn)為是人體內(nèi)環(huán)境對(duì)外來病原微生物免疫的第一道防線[9]。應(yīng)用hβD-2 的基因治療可介導(dǎo)抗腫瘤免疫，增強(qiáng)抗腫瘤作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)加載MAGE-A10 及hβD-2 雙基因的溶瘤病毒SG502-MAGE-A10-hβD-2 可抑制T24及MB49 細(xì)胞的增殖，且對(duì)MB49 細(xì)胞成瘤小鼠腫瘤的生長具有抑制作用。

溶瘤病毒可激發(fā)機(jī)體自身的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生免疫原性，同時(shí)調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境[21-23]。TNF-α 具有抗感染與抗腫瘤作用[24]。而IFN-γ 具有免疫調(diào)節(jié)及重要的抗腫瘤作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)：SG502 組TNF-α、IFN-γ 水平均高于對(duì)照組，SG502-MAGE-A10-hβD-2 組TNF-α、IFN-γ 水平高于SG502 組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。提示溶瘤病毒SG502-MAGE-A10-hβD-2 具有抗腫瘤及免疫增強(qiáng)作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，SG502-MAGE-A10-hβD-2可抑制T24及MB49 細(xì)胞的增殖，抑制MB49 成瘤小鼠腫瘤生長，并可以刺激小鼠分泌TNF-α 及IFN-γ，以上研究結(jié)果為未來研究膀胱癌腫瘤疫苗提供了依據(jù)。