郭思彤 尚莉麗

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，安徽合肥 230031

支氣管哮喘是小兒時(shí)期易患的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病原因與多種細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥相關(guān)，遷延不愈則易損傷患兒心肺功能[1]。按照2019 年全球哮喘防治創(chuàng)議方案，控制兒童哮喘癥狀和降低未來發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的首選藥物仍是糖皮質(zhì)激素[2]。但有研究[3]表明約有20%的患兒哮喘并未得到控制。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β2（transforming growth factor β2，TGF-β2）是氣道慢性炎癥發(fā)作的重要因素。本課題組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)驗(yàn)豐富[4-6]，本實(shí)驗(yàn)通過建立哮喘豚鼠干預(yù)模型，觀察息風(fēng)定喘方對(duì)模型豚鼠肺組織病理改變及對(duì)VEGF、EGF、TGF-β2 的影響，研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

72 只3～4 周齡體重（165±15）g 普通級(jí)的雄性豚鼠。由南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場(chǎng)提供[合格證號(hào)：NO.202 009237；許可證號(hào)：SCXX（蘇）2019-0005]。飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室內(nèi)溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度50%～70%。動(dòng)物倫理批準(zhǔn)編號(hào)：AHUCM-guinea pigs-2020007）。

1.2 藥物

息風(fēng)定喘方顆粒劑（由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：粵20160214），藥物組成：以小青龍湯為基礎(chǔ)加用僵蠶、地龍、全蝎。地塞米松片：0.75 mg/片（上海上藥信宜藥廠有限公司，批號(hào)：H31020793）。雞卵清蛋白（美國Sigma 公司，批號(hào)：A5253）。

1.3 試劑與儀器

VEGF、EGF、TGF-β2 試劑盒（Abcam 公司，批號(hào)：GR2021-01）。402AI 醫(yī)用超聲霧化吸入器（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司，型號(hào)：WH-2000）；低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TG-16M）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，型號(hào)：MK3）；恒溫水浴鍋（Leica，型號(hào)：HI1210）；正置顯微鏡（NIKON 公司，型號(hào)：ECLIPSE Ni）。

1.4 研究方法

1.4.1 動(dòng)物分組 將72 只幼齡雄性豚鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組，寒哮模型組，息風(fēng)定喘方高、中、低劑量組及地塞米松組，每組12 只。

1.4.2 模型制備 依據(jù)中醫(yī)寒哮動(dòng)物模型建立方法[7-9]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，分別于第8、15 天進(jìn)行腹腔注射，造模各組注射10%卵清蛋白和氫氧化鋁混合溶液1 ml 致敏，正常對(duì)照組注射等劑量生理鹽水。第2 次腹腔注射致敏1 周后，造模各組用1%卵清蛋白溶液霧化激發(fā)哮喘，30 min/次，1 次/d，持續(xù)1 周，每次結(jié)束后將其放置于0～4℃的恒溫箱內(nèi)給予寒冷刺激1 h；正常對(duì)照組霧化用等劑量生理鹽水代替。當(dāng)豚鼠逐漸出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、煩躁不安等哮喘癥狀，同時(shí)有畏寒、顫抖、噴嚏、流涕等現(xiàn)象[10]，提示寒性哮喘模型造模成功。

1.4.3 給藥方法 造模成功后，實(shí)驗(yàn)第29 天，參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[11]，按人與豚鼠體表面積換算公式計(jì)算給藥劑量。息風(fēng)定喘方高、中、低劑量組分別予息風(fēng)定喘方顆粒劑22.72、11.36、5.68 g/（kg·d）（劑量均為每袋顆粒劑所含的中藥生藥量）。地塞米松組予0.75 mg/片規(guī)格的地塞米松0.05 mg/（kg·d）。正常對(duì)照組和寒哮模型組予生理鹽水10 ml/（kg·d）。每天固定時(shí)間段灌胃1 次，連續(xù)21 d。

1.4.4 血清VEGF、EGF 及TGF-β2 水平測(cè)定 末次給藥后予禁食24 h，造模各組最后以1%卵蛋白溶液霧化激發(fā)后取材?？紤]每組均有不同原因致死（2～4 只）情況發(fā)生，每組取8 只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取材。以濃度20%的烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉并完成5 ml 腹主動(dòng)脈采血，離心15 min（4℃，離心半徑8.4 cm，速率3500 r/min），分離血清。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中VEGF、EGF及TGF-β2 水平。按照相關(guān)試劑盒提供方法操作。

1.4.5 肺組織病理變化觀察 腹主動(dòng)脈采血完成后，立即取出肺組織，固定2～3 d 后依次進(jìn)行脫水、包埋，切片成4～7 μm 的厚度，HE 染色后，光鏡下觀察豚鼠肺組織的病理改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

參與哮喘造模的各組豚鼠在激發(fā)階段，逐漸出現(xiàn)搔鼻、噴嚏，頻繁抓耳撓腮等典型哮喘癥狀。藥物干預(yù)后，豚鼠噴嚏及咳嗽癥狀改善，食量增加、體重增長速度增快，被毛光澤恢復(fù)，其中息風(fēng)定喘方高劑量組豚鼠癥狀改善情況優(yōu)于息風(fēng)定喘方中、低劑量組。

2.2 各組肺組織病理情況

正常對(duì)照組的肺組織整體結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。寒哮模型組肺泡間隔增厚增寬，肺泡腔內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生，氣道腔黏液增多。與寒哮模型組比較，息風(fēng)定喘方各劑量組氣道改變均有減輕，有不同程度炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔厚度降低。見圖1。

圖1 各組豚鼠肺組織病理變化（HE，200×）

2.3 各組血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比較

與正常對(duì)照組比較，寒哮模型組血清中VEGF、EGF、TGF-β2 含量升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。與寒哮模型組比較，息風(fēng)定喘方各劑量組的VEGF、EGF、TGF-β2 含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。息風(fēng)定喘方低、中劑量組血清VEGF 含量均高于息風(fēng)定喘方高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；息風(fēng)定喘方中、低劑量組血清VEGF 含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。息風(fēng)定喘方低劑量組血清EGF 含量高于息風(fēng)定喘方高、中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。息風(fēng)定喘方高劑量組與息風(fēng)定喘方中劑量組血清EGF 含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。息風(fēng)定喘方低劑量組血清TGFβ2 含量高于息風(fēng)定喘方高、中劑量組，息風(fēng)定喘方中劑量組血清TGF-β2 含量高于息風(fēng)定喘方高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比較（pg/ml，）

表1 各組血清VEGF、EGF、TGF-β2 含量比較（pg/ml，）

注：與正常對(duì)照組比較，aaP ＜0.01；與寒哮模型組比較，bP ＜0.05；與息風(fēng)定喘方高劑量組比較，cP ＜0.05；與息風(fēng)定喘方中劑量組比較，dP ＜0.05。VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；EGF：表皮生長因子；TGF-β2：轉(zhuǎn)化生長因子β2

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘發(fā)作時(shí)主要病機(jī)為“風(fēng)痰阻肺”[12]，寒性哮喘則是發(fā)病時(shí)具有氣喘咳嗽、喉間哮鳴、痰稀色白、形寒肢冷等一系列證候的病證[13]。息風(fēng)定喘方是尚莉麗教授依據(jù)“內(nèi)風(fēng)”[14-15]理論，從“伏邪”[16]角度，以治療寒性哮喘之經(jīng)方小青龍湯為主方，加僵蠶、地龍、全蝎三味蟲類藥組成的自擬方，已長期應(yīng)用于臨床，并取得很好的療效。蟲類藥物因其性擅走竄、可入絡(luò)搜風(fēng)、息風(fēng)止痙[17]，可使肺氣宣降得宜、內(nèi)風(fēng)得息、氣道攣急得以緩解。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)僵蠶、地龍、全蝎等蟲類藥有緩解支氣管痙攣，降低氣道高反應(yīng)性等作用[18-20]。

VEGF 作為刺激血管生成的重要信號(hào)蛋白[21]，可使炎癥細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)向炎癥部位遷移，幫助炎癥的發(fā)展和持續(xù)[22]。EGF 則可刺激表皮細(xì)胞等的增殖[23]，氣道組織中EGF 可在異常刺激下與高分泌的肝素結(jié)合，介導(dǎo)氣道重塑過程[24]。TGF-β 是支氣管哮喘發(fā)作時(shí)影響氣道重塑的重要介質(zhì)，其可以促進(jìn)上皮纖維化、杯狀細(xì)胞和平滑肌增生[25]。

本研究結(jié)果顯示，息風(fēng)定喘方對(duì)寒性哮喘豚鼠有一定的治療作用，其可能機(jī)制是通過調(diào)節(jié)VEGF、EGF、TGF-β2 水平達(dá)到降低炎癥因子含量，抑制細(xì)胞增殖，控制氣道炎癥，改善氣道重塑的目的，從而產(chǎn)生療效。