艾正文

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)，因此是微生物生長繁殖的良好基礎(chǔ)。牛乳在運輸、貯藏及加工過程中極易混入微生物，其中包括分解蛋白質(zhì)和脂肪的細菌以及酵母和霉菌等。此外，牛乳中還含有蛋白酶、脂酶等多種生物酶。這些微生物和酶對食品安全和產(chǎn)品保質(zhì)期都會產(chǎn)生較大影響。目前通常采用熱處理的方式將牛乳中的微生物和酶滅活，以達到保證食品安全和延長保質(zhì)期的目的。常用的熱處理殺菌方式有巴氏殺菌、高溫殺菌、超高溫殺菌及超瞬時殺菌等[1]。傳統(tǒng)的高壓均質(zhì)作為一種顆粒微?；侄?，在減小顆粒粒徑、防止產(chǎn)品分層、增加體系穩(wěn)定性[2]及提高產(chǎn)品品質(zhì)[3]等方面具有廣泛應(yīng)用。近些年，隨著耐壓材料的突破以及制造工藝的進步，均質(zhì)壓力由常規(guī)的20～100 MPa，最高可提高至400 MPa以上的超高壓力[4]。與傳統(tǒng)熱處理和高靜壓殺菌方式相比，超高壓均質(zhì)殺菌具有對熱敏性成分損失小、能耗低、可連續(xù)化生產(chǎn)等諸多優(yōu)勢[5]。因此超高壓均質(zhì)的應(yīng)用研究目前也成為熱點，本文綜述超高壓均質(zhì)對液體食品，特別是牛乳中微生物和酶的影響，為超高壓均質(zhì)在殺菌和滅酶中的應(yīng)用提供參考。

1 超高壓均質(zhì)殺菌和滅酶機理

流體在超高壓均質(zhì)時，大致會經(jīng)歷4 個階段，即紊流區(qū)、空化區(qū)、內(nèi)爆區(qū)及凝聚區(qū)[6]。當物料以超過200 m/s的速率通過幾微米到幾十微米的均質(zhì)閥，均質(zhì)帶來的剪切、湍流和空化現(xiàn)象急劇增加，產(chǎn)品在處理過程中由于壓力的變化，溫度瞬間增加[7]，這為液體產(chǎn)品的殺菌和滅酶提供了新的可能[8]。研究表明，均質(zhì)壓力每增加100 MPa，物料溫度提高16～20 ℃，但是物料在均質(zhì)閥中保留的時間極短（0.1 s左右），因此相較于超高溫滅菌，物料在超高壓均質(zhì)中受到的熱負荷相對更低[9]。從超高壓均質(zhì)和超高溫殺菌不同溫度和時間下的微生物致死曲線可以看出，超高壓均質(zhì)要達到理想的芽孢滅活窗口條件，均質(zhì)閥中物料瞬間溫度可能要不低于145 ℃（t≥0.1 s）[9]，嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌可以作為評價超高壓均質(zhì)殺菌是否徹底的指示菌[10]。

牛乳中酶的數(shù)量超過60 種，主要來源于牛乳腺組織及血漿中，還有相當一部分酶由乳中各種微生物分泌產(chǎn)生。酶在食品加工和貯藏過程中會導(dǎo)致食品發(fā)生一些不良的風(fēng)味和相的變化，從而影響產(chǎn)品的貨架期[11]。通常酶具有四級結(jié)構(gòu)，在自然狀態(tài)下呈現(xiàn)一定程度的折疊和卷曲，高壓均質(zhì)時由于巨大的剪切力和空化作用以及隨之產(chǎn)生的溫度變化，會使蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度解聚[12]，發(fā)生不可逆的展開和凝聚，從而導(dǎo)致酶的失活。但是不同的酶對壓力耐受程度則表現(xiàn)不同，對于諸如中性蛋白酶等壓力敏感的酶，即使在50 MPa左右壓力下也會失活變性。此外，部分酶在低壓條件下（通常100 MPa以內(nèi)），經(jīng)超高壓均質(zhì)處理后酶活會有比較明顯的提升，這可能與處理后暴露了酶的活性位點有關(guān)[13]。

2 超高壓均質(zhì)對牛乳中微生物滅活的影響

目前，隨著我國奶牛養(yǎng)殖條件的改善，原料乳中細菌總數(shù)大幅降低，接近或部分已經(jīng)低于歐盟標準，但是仍然無法避免牛乳受到微生物的污染。原料乳中的微生物種類大致可以分為3 類：1）病原微生物，如沙門氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌及可能存在的布魯氏菌等；2）諸如蛋白分解菌、脂肪分解菌及芽孢菌等引起乳制品腐敗變質(zhì)的腐敗菌；3）一些有益或者無害的微生物，如乳酸菌等[14]。超高壓均質(zhì)帶來的強大機械力會導(dǎo)致微生物細胞膜破裂，以及動能帶來的溫度激變引起細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，從而達到滅活微生物的目的?，F(xiàn)有研究顯示，微生物種類及處理條件均影響超高壓均質(zhì)的滅菌效果。Peredal等[15]研究表明，牛乳進樣溫度為40 ℃、均質(zhì)壓力達到300 MPa時的滅菌效果與常規(guī)熱處理殺菌（90 ℃、15 s）效果基本一致，滅菌效率可以達到99%。相似地，當生乳的進樣溫度為55 ℃和70 ℃，均質(zhì)壓力超過200 MPa時，超高壓均質(zhì)均具有良好的滅菌效果，經(jīng)過處理的生乳細菌總數(shù)、嗜冷菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌均未檢出，但是樣品在4 ℃條件下保存14 d，其細菌總數(shù)、嗜冷菌、假單胞菌數(shù)量均超過7（lg（CFU/mL）），超高壓均質(zhì)在延長牛乳貨架期方面仍存在一定局限性[16]。同時，牛乳中還含有嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等芽孢菌及其孢子。目前商業(yè)化純牛乳產(chǎn)品必須經(jīng)過超高溫滅菌（137～145 ℃、3～7 s）才能達到商業(yè)無菌，主要原因在于芽孢及其孢子十分耐熱，只有高強度熱處理才能將芽孢滅活?，F(xiàn)有超高壓均質(zhì)處理，單一的均質(zhì)壓力對微生物，特別是芽孢的滅活能力有限。Sevenich等[9]研究表明，當進口溫度超過一定溫度后（＞80 ℃），結(jié)合300～350 MPa壓力，可以達到滅活芽孢的目的，而微生物滅活的主導(dǎo)效應(yīng)可能是壓力增加帶來的急劇溫度變化（出口溫度＞140 ℃）。

隨著研究的深入，除了均質(zhì)溫度和均質(zhì)壓力能夠直接影響殺菌效果，超高壓均質(zhì)設(shè)備均質(zhì)閥的幾何結(jié)構(gòu)同樣會影響滅菌效率。Donsi等[17]研究表明，柱塞閥對大腸埃希氏菌、德氏乳桿菌及釀酒酵母的滅活效率高于孔板閥，主要的原因可能在于柱塞閥的間隙更小（3～14 μm），相對于孔板閥（130 μm左右）產(chǎn)生的空化作用更加強烈。超高壓均質(zhì)對牛乳中微生物影響的部分研究如表1所示。

表 1 超高壓均質(zhì)對牛乳中微生物的影響Table 1 Effect of ultra-high pressure homogenization on sterilizing microorganisms in milk

3 超高壓均質(zhì)對牛乳中酶滅活的影響

牛乳中天然含有溶菌酶、乳過氧化物酶和磷酸酶等酶系。此外，牛乳中的微生物還會分泌產(chǎn)生蛋白酶和脂酶等生物酶，這些酶對牛乳的品質(zhì)具有重要影響。研究表明，牛乳中的溶菌酶和乳過氧化物酶具有天然的抑菌活性[24]，但是其中部分蛋白酶和脂酶是造成牛乳凝結(jié)、口味發(fā)苦和變質(zhì)的重要因素。超高壓均質(zhì)對食品中酶的處理研究起步相對較晚[13]。dos Santos Aguilar等[25]研究表明，均質(zhì)壓力可以改變酶的結(jié)構(gòu)，使氨基酸和巰基基團暴露，從而影響酶的功能。酶的四級結(jié)構(gòu)在相對較低的壓力下就可以發(fā)生解離，當壓力超過150 MPa及出口溫度較高時，酶的二級結(jié)構(gòu)中的氫鍵和二硫鍵會隨之發(fā)生變化，但是超高壓均質(zhì)對酶的一級結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響，即目前無法破壞共價鍵[26]。超高壓均質(zhì)作為一種新興的、潛在的可替代傳統(tǒng)熱處理的加工方式，其對牛乳中酶的影響也逐漸得到深入研究。

3.1 堿性磷酸酶

在乳品工業(yè)中，由于堿性磷酸酶的失活溫度略高于牛乳中致病微生物滅活的溫度，當生牛乳在加工過程中堿性磷酸酶失活意味著牛乳中全部致病菌在熱處理時已被滅活。因此，堿性磷酸酶可以作為一種指示酶，它是判斷巴氏殺菌乳殺菌效果的重要參考指標[27]。研究表明，堿性磷酸酶相對不耐熱，在70 ℃條件下加熱16 s左右就基本完全失活[14]。但是，與熱處理不同的是，通常當均質(zhì)壓力處于較低水平時，大多數(shù)酶活力明顯升高。Picart等[28]研究表明，當均質(zhì)壓力100～150 MPa、進口溫度24 ℃時，堿性磷酸酶活性有一個增加的過程，但是當均質(zhì)壓力升高至270 MPa時，堿性磷酸酶活性顯著減少約91%。Pinho等[29]的研究結(jié)果也顯示，均質(zhì)壓力超過270 MPa后，堿性磷酸酶基本全部失活。此外，超高壓均質(zhì)對堿性磷酸酶的滅活效率與樣品的進口溫度具有相關(guān)性。通過預(yù)熱并結(jié)合壓力可以顯著提高超高壓均質(zhì)的滅酶效率，當樣品進口溫度達到50 ℃以上，200 MPa壓力條件下就可以使堿性磷酸酶鈍化。同時，相對于均質(zhì)壓力，溫度對堿性磷酸酶活性的影響更大[30]。

3.2 乳過氧化物酶

乳過氧化物酶是牛乳中天然存在的一種單肽鏈蛋白質(zhì)，它具有天然抑菌特性。研究表明，乳過氧化物酶系在生鮮乳保鮮中發(fā)揮著重要作用[31]。乳過氧化物酶相對比較耐熱，其失活條件為72 ℃、1.5 min，或超過80 ℃、幾秒鐘就可以失活[32]。超高壓均質(zhì)對乳過氧化物酶的活性具有雙面性。低壓條件下（75、100、130 MPa，進樣溫度37 ℃）可以提高乳過氧化物酶的抑菌活性[33-34]。然而當均質(zhì)壓力達到200 MPa、樣品出口溫度超過60 ℃時，乳過氧化物酶開始失活，出口溫度超過80 ℃時則完全失活[30]。

3.3 溶菌酶

溶菌酶是牛乳中另一種抗菌酶類，可催化細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵，從而引起細菌溶解。溶菌酶經(jīng)過適當?shù)某邏壕|(zhì)處理，可以提高其抗菌活性[35]。Tribst等[36]研究表明，pH 6.5、20 ℃、120 MPa時溶菌酶的活性明顯高于其他實驗組。這可能是由于高壓均質(zhì)后溶菌酶疏水基團暴露[37]。此外，溶菌酶結(jié)合超高壓均質(zhì)可以提高壓力對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抗菌效果，通過透射電鏡可以觀察到細菌總數(shù)的下降，不僅僅是由于均質(zhì)壓力對細菌細胞壁或細胞膜的作用[23]。

3.4 其他酶類

相較于堿性磷酸酶和乳過氧化物酶，針對牛乳中蛋白酶和脂酶等酶的超高壓均質(zhì)研究相對較少。Datta等[38]對生牛乳中的脂酶和纖維蛋白溶解酶經(jīng)過超高壓處理后的酶活進行研究，研究表明，預(yù)熱協(xié)同超高壓處理可以有效降低牛乳中的脂酶和纖維蛋白溶解酶活力，此外，相對于熱處理，纖維蛋白溶解酶對均質(zhì)壓力更敏感，200 MPa時樣品出口溫度超過74 ℃時，纖維蛋白溶解酶失活超過90%。假單胞菌作為牛乳中一種常見的嗜冷菌，其產(chǎn)生的胞外蛋白酶能使乳制品中的蛋白質(zhì)分解變質(zhì)，從而影響產(chǎn)品的貨架期[13]。超高壓均質(zhì)對假單胞菌蛋白酶同樣具有一定的滅活作用。150 MPa壓力下生乳樣品（脂肪含量3g/100 g）中的假單胞菌蛋白酶可減少51%，但是對脫脂乳中的假單胞菌產(chǎn)生的蛋白酶水解無明顯抑制作用，可能的原因是牛乳中的脂肪球經(jīng)過超高壓均質(zhì)處理后，脂肪球碎片吸附在蛋白質(zhì)表面可以顯著抑制牛乳蛋白質(zhì)的水解[39]。

超高壓均質(zhì)對牛乳中酶影響的部分研究如表2所示。

表 2 超高壓均質(zhì)對牛乳中酶的影響Table 2 Effect of ultra-high pressure homogenization on inactivating enzymes in milk

4 結(jié) 語

超高壓均質(zhì)作為一種新興的加工方式，在生物、醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。由于超高壓均質(zhì)可以連續(xù)化生產(chǎn)及熱負荷較低等優(yōu)勢，相對于靜態(tài)超高壓處理優(yōu)勢更加明顯。目前在乳制品加工領(lǐng)域，超高壓均質(zhì)在殺滅牛乳中的微生物方面已表現(xiàn)出潛力，其已成為一種潛在的可替代傳統(tǒng)熱處理的加工方式。同時，牛乳中的各種內(nèi)源性或外源性酶對產(chǎn)品品質(zhì)的影響仍然不容忽視。如果超高壓均質(zhì)的加工參數(shù)僅考慮微生物安全性，仍無法達到保證食品安全和延長產(chǎn)品貨架期的目的。未來超高壓均質(zhì)在乳品中的應(yīng)用必須要同時兼顧微生物和酶的處理效果。目前超高壓均質(zhì)雖然仍然存在一定局限，例如，現(xiàn)有條件很難完全殺滅牛乳中的芽孢和孢子，同時超高壓設(shè)備造價很高、均質(zhì)壓力和單位時間處理能力仍有待進一步提高。