陳梁玥 段怡平 柳家翠 馬甜甜 朱翠雯 李東旭 劉永豪 李慧 喻明霞★

2019年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示消化系統(tǒng)腫瘤新增病例數(shù)和死亡人數(shù)均位居世界第一，而結(jié)直腸癌（Colorectal Cancer，CRC）兩者均位居消化系統(tǒng)榜首［1］。根據(jù)我國(guó)惡性腫瘤死亡率排名，在男性中居第5 位，女性中居第4 位［2］。CRC 起病隱匿，早期癥狀不明顯且不典型，缺乏特異性，有時(shí)與其他消化系統(tǒng)疾病共存，因此其發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期，且部分患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶［3］。盡管目前對(duì)CRC 的治療方式有手術(shù)切除、放化療、基因治療等多種手段，但其五年生存率仍不足50%［4］。因此，通過(guò)CRC 預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)CRC 患者的預(yù)后進(jìn)行早期評(píng)估，成為了必然。

鐵死亡（Ferroptosis）是一種非凋亡形式的細(xì)胞死亡，其特征是鐵依賴(lài)性脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的積累達(dá)到細(xì)胞致死水平［5］。自鐵死亡機(jī)制被提出以后，人們?cè)诙喾N疾病發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵過(guò)程中證實(shí)了鐵死亡的作用，如阿爾茲海默病、急性腎損傷、腫瘤的增殖與凋亡等［6］。Zhang［7］等發(fā)現(xiàn)，苯并吡喃衍生物能通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/mTOR/p70S6k 信號(hào)通路的活性下調(diào)SLC7A11的表達(dá)，降低半胱氨酸和谷胱甘肽的含量來(lái)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的鐵死亡。而Malfa［8］等證實(shí)樺木樹(shù)提取物通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞微環(huán)境氧化，導(dǎo)致血紅素加氧酶?1 表達(dá)水平增高提高細(xì)胞內(nèi)游離鐵濃度，從而誘導(dǎo)鐵死亡。此外，XIAN［9］等研究表明circABCB10可以通過(guò)調(diào)控miR?326/CCL5 軸促進(jìn)直腸癌細(xì)胞鐵死亡，從而成為潛在的治療靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中CRC 的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法篩選與CRC 預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因，并加以分析構(gòu)建臨床預(yù)后模型，以期為CRC 的診療及預(yù)后提供評(píng)估參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

從TCGA（http：//gdc?portal.nci.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載CRC 患者腫瘤組織癌旁組織的mRNA 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床資料，其中包括568 個(gè)腫瘤組織和44 個(gè)正常組織。對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并Log2 轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。排除了臨床信息缺失或患者生存時(shí)間為0 的樣本，最終納入了538 名CRC 患者。

使用Strawberry Perl 5.32.1 軟件將原始基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理成基因表達(dá)矩陣文件。

1.2 方法

1.2.1 鐵死亡相關(guān)基因的提取和處理

基于美國(guó)國(guó)家生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的60 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因（Iron death?related genes，IRGs），用于后續(xù)對(duì)照分析。通過(guò)R語(yǔ)言“l(fā)imma”包對(duì)腫瘤和癌旁組織進(jìn)行差異分析，篩選出鐵死亡相關(guān)的差異基因（Differentially ex?pressed gene，DEGs）。篩選閾值為偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.05。運(yùn)用R 語(yǔ)言“Venn 包”對(duì)具有差異和價(jià)值的IRGs 取交集，并繪制熱圖。

1.2.2 預(yù)后模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

為了達(dá)到最大化減小過(guò)度擬合風(fēng)險(xiǎn)的目的，采用LASSO Cox 回歸分析并結(jié)合R 語(yǔ)言“glmnet”包再次篩選基因?；貧w分析中的獨(dú)立變量為交集基因的表達(dá)量，而響應(yīng)變量是TCGA 隊(duì)列中患者的總體生存率和生存狀態(tài)。根據(jù)每個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分表達(dá)式如下：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（Risk Score），其中N 是基因數(shù)，Expi 是基因的表達(dá)水平，Ci 是LASSO 回歸分析得到的回歸相關(guān)系數(shù)。根據(jù)預(yù)后模型得到的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分求其中位數(shù)，將納入的CRC 患者劃分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。對(duì)兩組采用Kaplan?Meier 方法繪制生存曲線(xiàn)，同時(shí)使用R 語(yǔ)言“time ROC”包來(lái)評(píng)估預(yù)后模型的預(yù)測(cè)能力。根據(jù)下載整理的臨床病理信息，采用單因素和多因素COX 回歸對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行分析，以驗(yàn)證構(gòu)建的預(yù)后模型是否能作為獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。

1.2.3 功能富集分析和免疫功能狀態(tài)分析

通過(guò)R 語(yǔ)言“cluster profiler”和“l(fā)imma”包對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的DEGs 進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）分析。此外，基于R 語(yǔ)言“gsva”包，通過(guò)單樣本基因集富集分析（ssGSEA）對(duì)16 個(gè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行打分，并分析13 個(gè)免疫相關(guān)的通路。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用R（4.0.2）和SPSS Statistic25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；使用Wilcoxon 非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析腫瘤樣本和癌旁樣本中的基因表達(dá)差異；采用χ2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料之間的差異進(jìn)行分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定與鐵死亡相關(guān)的差異預(yù)后基因

大部分IRGs 在腫瘤組織和臨近組織間存在差異表達(dá)（83.3%，50/60），見(jiàn)圖1A。單因素COX 分析顯示，有6 個(gè)基因與預(yù)后相關(guān)，并繪制了基因表達(dá)熱圖（圖1B?C），同時(shí)進(jìn)行了LASSO 回歸分析，見(jiàn)表1。

表1 6 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的詳細(xì)信息Table 1 Information of the 6 genes associated with iron?death

2.2 構(gòu)建預(yù)后模型和評(píng)價(jià)

PCA 和t?SNE 分析表明，高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)兩組患者分布在兩個(gè)方向，見(jiàn)圖2A?B。Kaplan?Meier 生存曲線(xiàn)提示低風(fēng)險(xiǎn)組總體生存率顯著高于高風(fēng)險(xiǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2C。并繪制受試者工作曲線(xiàn)（AUC1=0.594，AUC2=0.708，AUC3=0.599，圖2D）。同時(shí)，對(duì)患者進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖3A?B）。單因素和多因素COX 分析提示，該預(yù)后模型可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子（P<0.05）（圖3C?D）。

圖2 模型的預(yù)測(cè)效能檢驗(yàn)Figure 2 Predictive power test of the model

圖3 預(yù)后模型的生存狀態(tài)及COX 回歸分析Figure 3 Survival status and COX regression analysis of the prognostic model

2.3 功能分析

GO 分析中，DEGs 富集在金屬離子的隔離以及離子門(mén)控通道活性等幾個(gè)鐵相關(guān)的通路，此外，DEGs 也明顯富集在與免疫相關(guān)的通路中，如補(bǔ)體的激活等。KEGG 分析中，在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用等與免疫反應(yīng)相關(guān)的功能通路富集。見(jiàn)表2。

表2 GO 富集分析和KEGG 通路分析Table 2 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis

ssGSEA 分析表明，巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等在兩組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組之間的免疫功能比較，除Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合物（MHC）外，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 不同風(fēng)險(xiǎn)組之間ssGSEA 評(píng)分Figure 4 ssGSEA scores between different risk groups

3 討論

在本研究中，通過(guò)文獻(xiàn)查閱和數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，系統(tǒng)的分析了60 個(gè)IRGs 在CRC 組織中的表達(dá)與其總體生存率之間的關(guān)系，首次構(gòu)建了一個(gè)關(guān)于6個(gè)IRGs 的預(yù)后模型。該模型將538 例CRC 患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，兩組患者DEGs 在鐵相關(guān)和免疫相關(guān)的通路中被富集。一些基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)某種激活劑或抑制劑進(jìn)而調(diào)控腫瘤的鐵死亡［10］，但這些基因的表達(dá)與CRC 患者的生存預(yù)后之間的相關(guān)性仍不清楚。但值得注意的是，大約83.3%的IRGs 在CRC 組織和癌旁組織之間存在有差異表達(dá)，單因素COX 分析顯示有6 個(gè)基因與總體生存預(yù)后相關(guān)。這表明鐵死亡在CRC 中具有潛在的作用，因此，利用IRGs 建立CRC 預(yù)后模型是有意義的。

本研究構(gòu)建的預(yù)后模型由6 個(gè)IRGs 組成，包括AKR1C1、ATP5MC3、HMGCR、CRYAB、FDFT1、ALOX12。人Aldo?keto 還原酶1 家庭成員C1（Human Aldo?keto reductase 1 family member C1，AKR1C1）的過(guò)度表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥［11］，并通過(guò)催化醛酮轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇，解毒活性脂質(zhì)過(guò)氧化物分子，進(jìn)而影響鐵死亡進(jìn)程［12］。ATP5MC3又稱(chēng)ATP5G3，編碼線(xiàn)粒體ATP 合成酶亞單位，參與腫瘤的多種生物學(xué)過(guò)程，并抑制了erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡［13］。3?羥基?甲基戊二醇?CoA還原酶（3?hydroxy?methylpentanediol?CoA reduc?tase，HMGCR）在甲戊酸的合成中發(fā)揮重要作用，Shimada 等人發(fā)現(xiàn)抑制HMGCR可增強(qiáng)FIN?56 誘導(dǎo)的鐵死亡［14］。CRYAB是小型熱休克蛋白家族的一員，參與調(diào)節(jié)腫瘤中的幾種信號(hào)通路，有報(bào)道稱(chēng)其可以調(diào)節(jié)鐵的攝入量和GPX4 的豐度［15］。角鯊烯合成酶（Squalene synthase，F(xiàn)DFT1）是合成甾醇并最終合成膽固醇的關(guān)鍵酶，該基因的敲低與CRC 的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)，并通過(guò)負(fù)調(diào)控AKT/mTOR/HIF1α 通路抑制腫瘤發(fā)生［16］。ALOX12是脂氧合酶超家族成員之一，有氧條時(shí)催化多不飽和脂肪酸底物形成氫基二十碳四烯酸，有研究證明，ALOX12的失活減少了p53介導(dǎo)的鐵死亡，并消除了p53依賴(lài)的腫瘤生長(zhǎng)抑制［17］。綜上，這些基因在一定程度上影響CRC 的進(jìn)展，但其中的大部分基因是否通過(guò)鐵死亡機(jī)制來(lái)干擾CRC 患者的預(yù)后還尚不明確。

近年來(lái)鐵死亡在腫瘤領(lǐng)域的研究中較為熱門(mén)，但腫瘤免疫與鐵死亡之間的潛在調(diào)控機(jī)制尚不清楚。對(duì)高、低風(fēng)險(xiǎn)間的DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)這些DEGs 富集于一些與免疫相關(guān)的生物學(xué)通路和功能中。由此可推斷，鐵死亡與腫瘤的免疫功能之間可能存在密切關(guān)聯(lián)。此外，在ssGESA 分析中，發(fā)現(xiàn)抗原提呈過(guò)程在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間存在顯著差異，一種可能性是鐵死亡細(xì)胞釋放某些信號(hào)，吸引抗原提呈細(xì)胞，從而激活抗原提呈反應(yīng)［18］。同時(shí)，本研究通過(guò)對(duì)比分析，高風(fēng)險(xiǎn)組中有較高的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表達(dá)，既往研究已經(jīng)證實(shí)該類(lèi)細(xì)胞水平的升高與CRC 腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)［19］。

綜上所述，本文經(jīng)過(guò)多種生物學(xué)方法，構(gòu)建了6 個(gè)與鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型，可能為CRC患者的個(gè)體化治療和評(píng)估提供參考。