朱夫俊 張威 高勇 馬小蘭 張玉梅

結(jié)核病屬于慢性傳染性疾病，已成為全球公共的衛(wèi)生問(wèn)題［1］。隨著環(huán)境的污染與人們生活方式的變化，我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率及死亡率居高不下，已成為主要的傳染病之一［2］。肺結(jié)核的廣泛耐藥可能導(dǎo)致其成為不治之癥，故對(duì)肺結(jié)核進(jìn)行早期診斷、早期預(yù)防與治療是關(guān)鍵，也是我國(guó)結(jié)核病防治的重點(diǎn)［3］。痰涂片抗酸染色與痰培養(yǎng)是常用的診斷手段，但部分患者無(wú)法通過(guò)單純的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)確診，且痰培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法及時(shí)對(duì)患者的病情進(jìn)行診斷，從而耽誤治療，導(dǎo)致細(xì)菌擴(kuò)散，影響患者健康［4］。隨著肺結(jié)核疾病診斷技術(shù)的發(fā)展與臨床的重視增加，新型的診斷方式應(yīng)運(yùn)而生。GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)是一種高效、間接的分子診斷方式，在2 h 內(nèi)即可完成標(biāo)本的檢測(cè)，具有較好的敏感度與特異度［5］，被廣泛應(yīng)用在結(jié)核病的診斷中。但目前將其應(yīng)用在肺結(jié)核診斷并與傳統(tǒng)檢測(cè)方式進(jìn)行對(duì)比的研究較少，且關(guān)于其對(duì)耐藥性診斷的分析少見(jiàn)。本研究通過(guò)對(duì)96 例患者的臨床資料進(jìn)行分析比較，為結(jié)核患者早診治提供幫助，研究報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2021年11月阜南縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科收治的96 例肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，分析其臨床資料及疾病檢測(cè)結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《WS 288?2017 肺結(jié)核診斷》診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，經(jīng)影像學(xué)檢查確診或存在肺結(jié)核癥狀；②臨床資料完整；③未接受抗結(jié)核相關(guān)治療；④無(wú)妊娠、哺乳期婦女；⑤無(wú)其他的呼吸道感染疾??；排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫功能障礙；②合并既往存在結(jié)核病史；③合并嚴(yán)重的心肺功能障礙；④合并腫瘤；⑤合并認(rèn)知障礙。96 例患者中男性59 例、女性37 例，平均年齡（51.20±10.39）歲，平均病程（2.50±0.67）年。研究符合《赫爾辛基宣言》中的倫理審查標(biāo)準(zhǔn)。所有患者及家屬均鑒署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 痰涂片抗酸染色鏡檢

依據(jù)《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》［7］的要求進(jìn)行檢測(cè)，報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)的光學(xué)顯微鏡報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)并由具備相關(guān)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)人員進(jìn)行。

1.2.2 痰培養(yǎng)

依據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［8］準(zhǔn)備培養(yǎng)器材，使用4% NaOH 法對(duì)痰液樣本進(jìn)行處理，時(shí)間約為15 min，取0.1 mL 無(wú)菌操作接種在酸性羅氏培養(yǎng)基斜面，將其放在適當(dāng)溫度（36℃左右）的培育箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察陽(yáng)性結(jié)果，若8 周依然未出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)則判定為陰性。

1.2.3 比例法體外藥敏試驗(yàn)

用過(guò)接種環(huán)在培養(yǎng)基上取所需的菌落，進(jìn)行研磨操作，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙容^，調(diào)配1 mg/mL 菌懸液，將其依據(jù)梯度稀釋并將其接種在含利福平（40 μg/mL）的羅氏固體培養(yǎng)基與空白管培養(yǎng)基中，在37℃室溫條件下培育4 周并觀察培育結(jié)果。

1.2.4 GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)

在1 mL 的痰液樣本中加入2 mL 標(biāo)本緩沖劑，將樣本容器蓋緊并通過(guò)旋渦振蕩器振蕩30 s，在36℃室溫環(huán)境靜置15 min，待其充分液化而后將其放入反應(yīng)試劑盒，采用Xpert 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行操作（全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)GeneXpert Dx System，上海生科儀器有限公司），樣本的反應(yīng)時(shí)間為120 min，在檢查結(jié)束后通過(guò)檢測(cè)窗口觀察檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)內(nèi)對(duì)探針的循環(huán)閾值≤38 時(shí)判斷為陽(yáng)性反應(yīng)，若存在≥2 個(gè)探針的循環(huán)閾值≤38 則檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌。

1.2.5 質(zhì)量控制

阜南縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科每年均進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌涂片鏡檢、藥敏試驗(yàn)及結(jié)核分枝桿菌分子診斷技術(shù)能力的檢測(cè)工作，工作完成較好，成績(jī)有效且合格。本研究中相關(guān)的檢驗(yàn)均由同一組經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測(cè)人員進(jìn)行，能夠保證檢測(cè)的質(zhì)量。

1.3 觀察指標(biāo)

比較痰培養(yǎng)、痰涂片、GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)痰樣本的陽(yáng)性、弱陽(yáng)性及陰性檢測(cè)率；比較GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)、痰培養(yǎng)檢測(cè)痰結(jié)核分枝桿及菌GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)與傳統(tǒng)比例法檢測(cè)利福平耐藥的敏感度、特異度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 96 例痰樣本采用痰培養(yǎng)、痰涂片、GeneXpert MTB/RIF 的檢測(cè)結(jié)果

痰培養(yǎng)檢測(cè)痰結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性率40.63%顯著高于痰涂片檢測(cè)陽(yáng)性率20.83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.833，P<0.05）；GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率39.58%顯著高于痰涂片檢測(cè)陽(yáng)性率20.83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.004，P<0.05）；痰培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率40.63%高于GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率39.58%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.022，P>0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1 96 例痰樣本采用痰培養(yǎng)、痰涂片、GeneXpert MTB/RIF 的檢測(cè)結(jié)果比較Table 1 Comparison of the detection results of 96 sputum samples by sputum culture，sputum smear and GeneXpert MTB/RIF

圖1 痰涂片、抗酸染色、找抗酸桿菌，經(jīng)抗酸染色后鏡檢Figure 1 Sputum smear，acid?fast staining，looking for acid?fast bacilli，and microscopic examination after acid?fast staining

2.2 痰結(jié)核分枝桿菌采用GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)、痰培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果

將痰培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)痰涂片陽(yáng)性患者痰結(jié)核分枝桿菌的敏感度為93.75%（15/16）、特異度為25.00%（1/4），檢測(cè)痰涂片陰性患者檢測(cè)的敏感度為55.00%（11/20）、特異度為85.71%（48/56），檢測(cè)所有患者的敏感度為72.22%（26/36）、特異度為81.67%（49/60）。見(jiàn)表2。

表2 痰結(jié)核分枝桿菌采用GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)、痰培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果Table 2 Sputum Mycobacterium tuberculosis detection results using GeneXpert MTB/RIF technology and sputum culture

2.3 利福平耐藥采用GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)與傳統(tǒng)比例法檢測(cè)結(jié)果比較

將傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)痰涂片陽(yáng)性患者利福平耐藥敏感度為100.00%（1/1）、特異度為50.00%（1/2）；檢測(cè)痰涂片陰性患者利福平耐藥敏感度為75.00%%（3/4）、特異度為100.00%（3/3），GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)檢測(cè)所有患者利福平耐藥的敏感度為80.00%（4/5）、特異度為96.77%（30/31）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 利福平耐藥采用GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)與傳統(tǒng)比例法檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 Comparison of rifampicin resistance detection results using GeneXpert MTB/RIF technology and traditional ratio method

圖2 抗酸桿菌陽(yáng)性Figure 2 Acid?fast bacilli positive

3 討論

結(jié)核病在我國(guó)高發(fā)，其中以肺結(jié)核為常見(jiàn)疾病，該類(lèi)疾病的傳染性較高，若病情未得到有效控制將導(dǎo)致患者的生命安全受到威脅［9］。結(jié)核分枝桿菌是肺結(jié)核的病因，該類(lèi)細(xì)菌可以隨著患者的痰液排出體內(nèi)，故對(duì)痰液樣本中是否含有結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行判定是診斷患者是否確診為肺結(jié)核的關(guān)鍵［10］。痰涂片抗酸染色鏡檢的要求嚴(yán)格，只有當(dāng)菌落數(shù)量不少于5 000 條/mL 的時(shí)候才能顯示出陽(yáng)性結(jié)果，故嚴(yán)重影響患者的疾病檢出率［11］。痰培養(yǎng)亦為診斷結(jié)核病的傳統(tǒng)方式，但分枝桿菌的生長(zhǎng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，常見(jiàn)痰培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)均耗時(shí)久，雖有一定的診斷效果，但效率較低［12］。與前者相比，GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)的操作便捷，其檢測(cè)時(shí)間僅為2 h，對(duì)操作者只要通過(guò)基礎(chǔ)培訓(xùn)即可，故適用范圍較廣［13］。本研究中，Gen?eXpert MTB/RIF 技術(shù)在診斷肺結(jié)核展現(xiàn)出較為理想的診斷價(jià)值。

以往研究結(jié)果表明［14］，基于GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)的結(jié)核病診斷，能夠有效縮短患者耐藥篩查的時(shí)間，優(yōu)化診斷流程，對(duì)于基層醫(yī)院來(lái)說(shuō)手術(shù)的操作性能夠較好的掌握，提高了基層醫(yī)院對(duì)于結(jié)核病檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率，與本研究結(jié)果具有相似性。范國(guó)萍等［15］研究結(jié)果指出，GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)于新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核具有較好的診斷價(jià)值且診出速度較快，與比例法藥敏試驗(yàn)診斷結(jié)果具有一致性。本研究結(jié)果提示GeneXpert MTB/RIF技術(shù)與痰培養(yǎng)對(duì)肺結(jié)核分枝桿菌的診斷陽(yáng)性率均較高，以痰培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)診斷的敏感度與特異度均較高，究其原因在于：該系統(tǒng)是一種基于巢式實(shí)時(shí)PCR 的檢測(cè)方式，其具備樣品準(zhǔn)備、定量PCR 擴(kuò)增及熒光檢測(cè)等功能于一體，能夠自動(dòng)進(jìn)行操作，將檢測(cè)時(shí)間縮短，節(jié)約等待的時(shí)間，且具有良好的檢測(cè)效能。該技術(shù)的實(shí)施較為便捷，檢測(cè)中避免形成氣溶膠，降低了分枝桿菌的生物危害性，且其試劑盒是單獨(dú)存放的，能夠降低DNA 污染的可能性［16］，比起傳統(tǒng)檢測(cè)來(lái)說(shuō)更適用于臨床檢測(cè)；痰培養(yǎng)的診斷陽(yáng)性率也較高，但其檢測(cè)的時(shí)間久，無(wú)法及時(shí)獲取患者診斷的結(jié)果。GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)中具有多種分子信標(biāo)且檢測(cè)多種分子探針，能夠?qū)z測(cè)的區(qū)域進(jìn)行選擇性的覆蓋，故具有較高的敏感度，能夠很好診斷出肺結(jié)核分枝桿菌。除此之外，本研究結(jié)果，提示GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)于肺結(jié)核耐藥性的診斷效能較好，究其原因在于：大部分的利福平敏感菌株均有共同的核酸序列，且利福平耐藥菌株中超過(guò)95%均因?yàn)閞poB 基因的變異引起，故該基因與利福平相關(guān)，且能夠作為評(píng)價(jià)利福平耐藥菌株能力的依據(jù)，因此GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)對(duì)利福平耐藥的敏感度較高。

綜上所述，肺結(jié)核患者通過(guò)GeneXpert MTB/RIF 技術(shù)確診的敏感度、特異度相較于痰涂片抗酸染色與痰培養(yǎng)要好，且其對(duì)利福平耐藥的敏感度與特異度也較好，能夠?yàn)榉谓Y(jié)核患者早期診治提供有效參考。但本研究存在一些不足之處，例如樣本數(shù)量有限，且僅為單中心的回顧性分析，在今后的研究中將會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量并增加實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)性，使研究結(jié)果更具說(shuō)服力與科學(xué)性。