梅闖，蔡昆爭，黎紫珊，徐美麗，黃飛, *

1. 華南農業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東 廣州 510542；2. 廣東工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，廣東 廣州 510006

根據(jù) 2014年《全國土壤污染狀況調查公報》報道，污染最嚴重的土壤重金屬是Cd，Cd超標率高達7.0%（中華人民共和國環(huán)境保護部，2014）。稻田土壤中Cd移動性強、毒性大，易被農作物吸收，通過食物鏈累積于人體中，進而威脅人體健康（Gray et al.，2006；Xiao et al.，2019）。針對土壤重金屬污染，化學鈍化是常用修復方法之一（Khalid et al.，2017）。在眾多的鈍化劑中，近年來生物炭在吸附固定重金屬Cd等方面應用潛力巨大，引起國內外研究者的廣泛關注（Kavitha et al.，2018；Ali et al.，2020；陳志良等，2016）。

生物炭不但可以通過表面官能團直接吸附、固定重金屬，而且還可以通過改變土壤理化性質和微生物群落結構來影響土壤 Cd形態(tài)（張華緯等，2017；梁妮等，2021；劉娟等，2021）。譬如，Ma et al.（2020）研究表明，椰子殼生物炭可以顯著降低土壤中有效態(tài)Cd含量，提高土壤脲酶活性，以及增加土壤微生物群落的相對豐度。類似地，黃家慶等（2020）研究報道，花生殼生物炭可以通過提高土壤 pH，增強土壤中過氧化氫酶、脲酶和磷酸酶活性，以及提高細菌群落多樣性，從而降低重金屬Cd的毒害作用。然而，有研究表明，稻稈生物炭可以通過降低土壤細菌和真菌總量來降低有效態(tài)Cd含量（梁妮等，2021）。以上這些研究表明，生物炭可影響土壤重金屬形態(tài)轉化和土壤性質變化，而對土壤微生物群落結構與多樣性的影響研究鮮見報道。

本研究以韶關某地實際 Cd污染稻田土為研究對象，通過添加稻稈生物炭進行120天的室內土培實驗來分析土壤Cd形態(tài)、化學性質及微生物群落多樣性的變化特征，研究不同土壤化學性質與Cd形態(tài)之間的相互關系以闡明土壤Cd形態(tài)轉化的關鍵影響因素，同時探討了生物炭作用下微生物群落多樣性變化對Cd形態(tài)轉化的影響，從而揭示稻稈生物炭對稻田土壤 Cd形態(tài)轉化的作用特征與機制，為重金屬污染稻田修復實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤采自廣東省韶關市某區(qū)稻田土（表層0—20 cm），土樣經(jīng)風干處理后，混合均勻并過篩。土樣基本性質為：pH 5.67，有機質9.39 g·kg?1，全碳 5.45 g·kg?1，全氮 1.10 g·kg?1，全磷 0.29 g·kg?1，全鉀 32.20 g·kg?1，總鎘 0.46 mg·kg?1，總鋅 133.56 mg·kg?1，總鉛 103.14 mg·kg?1，總鎳 10.89 mg·kg?1，總鉻含量59.41 mg·kg?1。根據(jù)土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準（GB 15618—2018），稻田土屬于輕度Cd污染。原材料取自華南農業(yè)大學生態(tài)農場。將水稻秸稈沖洗干凈并烘干，粉碎過篩后置于熱解爐，在熱解溫度為700 ℃，時間為2—4 h的限氧條件下制備稻稈生物炭（BC），pH為11.23，比表面積230 m2·g?1，其他具體參數(shù)性質見Gao et al.（2019）。

1.2 實驗設計

根據(jù)前期的預實驗結果（Huang et al.，2020），處理組的生物炭（BC）投加量設置為5%，同時設實驗空白對照處理組（CK），每個處理設置3個平行組。保持田間持水量為60%，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中，分別在第7、14、21、28、45、60、90、120天取樣。樣品分成兩份，一份風干，一份置于4 ℃冰箱保存，之后根據(jù)土壤分析測定方法步驟進行下一步的指標測定；另外，還需將土壤樣品用干冰保存以進行環(huán)境微生物多樣性的測序分析（委托上海美吉生物科技有限公司測序）。

1.3 實驗分析方法

1.3.1 土壤化學性質與酶活性

土壤 pH、有機質（SOM）、陽離子交換量（CEC）、全氮（TN）、全磷（TP）、全鉀（TK）、堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）指標的測定方法參照《土壤農化分析》（鮑士旦，2000）。采用BCR連續(xù)提取法測定土壤中不同化學形態(tài)Cd的含量，提取順序為弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)，將提取后的土壤殘渣采用HNO3-HClO4微波消解。土壤重金屬全量以及各形態(tài)Cd含量用ICPOMS測定。土壤過氧化氫酶活性測定用高錳酸鉀滴定法，活性單位為 mL·g?1（25 ℃，20 min）；脲酶活性測定用苯酚鈉比色法，活性單位為 mg·g?1（37 ℃，24 h）；蔗糖酶活性測定采用3, 5?二硝基水楊酸比色法，活性單位為 mg·g?1（37 ℃，24 h）（關松蔭，1986）。

1.3.2 高通量測序

高通量測序土樣的取樣時間為試驗土中酸提取態(tài)Cd含量變化穩(wěn)定時，即為第120天。土壤總DNA采用 E.Z.N.A. ? soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）按說明書進行提取操作。采用Nanodrop 2000（Thermo，UAS）測定提取后土壤DNA濃度和純度。純化、質控后，建立Illumina測序文庫，采用Illumina Mi Seq平臺進行Paired-end 250測序（美吉生物，上海，http://www.majorbio.com）。測序引物選取細菌16S rRNA V4—V5區(qū)域的338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） /806R （ 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和真菌 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）/ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。 使 用 fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件和 Flash（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件對測序結果進行指控和拼接，根據(jù)序列兩端的序列結構和引物序列得出有效序列，校正序列方向。使用 UPARSE（http://drive5.com/uparse/，version 7.1）軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行 OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2）對每條序列與Silva 16S rRNA（version 138）數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得各個OTU的物種分類信息。

使用MOTHUR（v.1.30.1）對OTU進行α多樣性指數(shù)分析：

（1）Shannon指數(shù)用來反映群落多樣性，其值越大，說明群落多樣性越高：

式中：

Sobs——實際觀測的OTU數(shù)目；

ni——第i個OTU所含的序列數(shù)；

N——所有序列數(shù)。

（2）Simpson指數(shù)通常用來定量描述某一區(qū)域的生物多樣性，與Shannon多樣性指數(shù)類似：

式中：

Sobs——實際觀測的OTU數(shù)目；

ni——第i個OTU所含的序列數(shù)；

N——所有序列數(shù)。

（3）Ace指數(shù)用來評估群落中 OTU數(shù)目，反映群落豐富度：

ni——含有i條序列的OTU序列數(shù)；

Srare——含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；

Sabund——多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；

abund——“優(yōu)勢”O(jiān)TU的閾值，默認為10。

（4）Chao1指數(shù)多用來評估物種總數(shù)：

其中：

Sobs——實際觀測的OTU數(shù)目；

n1——只含有一條序列的OTU數(shù)目；

Model Test of Hydrodynamics Behavior of Side-By-Side LNG Bunkering Operation……………LOU Danping, CHEN Xiaoying, YUAN Hongliang(3·7)

n2——只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

利用 R（v.4.1.0）語言“vegan”包進行冗余（Redundancy analysis，RDA）分析和相關性Heatmap分析。在QIIME軟件中使用Mantel test對環(huán)境因子與微生物群落的相關性進行分析，并通過 R（v.4.1.0）語言“ggplot”包進行可視化分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

應用SPSS 21.0軟件進行不同處理間土壤理化性質的單因素方差分析，采用Duncan進行差異顯著性分析。應用Origin Pro 2021b進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與作圖。

2 結果與討論

2.1 生物炭對土壤Cd形態(tài)轉化的影響

稻稈生物炭作用下，土壤中4種形態(tài)Cd含量均發(fā)生了顯著性變化，弱酸提取態(tài)和可還原態(tài) Cd含量分別降低23.19%和21.64%（圖1a、b），可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Cd含量分別提高25.62%和28.42%（圖1c、d）。此外，在120 d土培期間，酸提取態(tài)和可還原態(tài)Cd含量表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，并在第45天之后，含量變化趨于穩(wěn)定，同時可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Cd含量有逐漸升高的趨勢，在第28天后含量變化不顯著。本實驗進一步采用重金屬的移動系數(shù)（Zahedifar，2020）評估土壤中Cd的潛在移動性。稻稈生物炭處理后，Cd移動系數(shù)顯著降低，降幅達33.19%。以上這些結果說明，稻稈生物炭通過45 d的土培能夠有效降低土壤酸提取態(tài)Cd含量，進而降低Cd危害程度。

圖1 生物炭對Cd形態(tài)含量的影響Figure 1 Influence of biochar additions on Cd-fractions content

吳萍萍等（2017）和李洪達等（2018）研究表明，生物炭均能顯著降低酸提取態(tài)Cd含量和提高殘渣態(tài)Cd含量。這可能是因為生物炭具有較為疏松的孔隙結構、較大的比表面積和豐富的含氧官能團，從而通過靜電吸附、離子交換和官能團絡合螯合等作用固定重金屬（梅闖等，2021）。另一方面，生物炭還能通過改變土壤酸性環(huán)境等（Xiao et al.，2018），促進Cd由酸提取態(tài)向殘渣態(tài)轉化，增加穩(wěn)定態(tài)重金屬含量。

2.2 生物炭對土壤pH、CEC、SOM和速效養(yǎng)分的影響

稻稈生物炭（BC）處理后，土壤pH值、CEC、SOM、AN、AP和AK的含量均顯著提高（圖2），其中土壤pH值提升約3個單位（圖2a），CEC和SOM含量分別提高9.74%和48.42%（圖2b、c），另外，AN、AP和AK速效養(yǎng)分含量分別提高19.17%、49.24%和81.28%（圖2d—f）。這些結果表明生物炭可能通過改變土壤pH、CEC、SOM、AN、AP和AK等性質，進而影響Cd化學形態(tài)的轉化。此外，通過將土壤化學性質與4種Cd形態(tài)進行冗余分析（RDA）（圖3），結果表明酸提取態(tài)Cd與SOM、AK、pH、CEC、AP呈負相關，而殘渣態(tài)與這些因子呈正相關，其中SOM、AK和pH對Cd形態(tài)變化的解釋度分別為92.5%、60.3%和41.2%（P<0.05）（表1），可能是影響Cd形態(tài)的主要因子。

圖2 生物炭對土壤化學性質的影響Figure 2 Influence of biochar additions on soil chemical properties

圖3 Cd形態(tài)與土壤化學性質的冗余（RDA）分析Figure 3 Redundancy analysis between Cd-fractions and soil chemical properties

表1 各指標對Cd形態(tài)影響的解釋度Table 1 Explanation of the influence of each index on Cd fractions

生物炭可以提高土壤 pH，這很可能是因為生物炭表面存在大量的碳酸鹽、微量的金屬氧化物和堿性官能團，進而降低土壤中H+離子含量（Yuan et al.，2011），同時，生物炭施入土壤后，表面可能發(fā)生氧化還原反應，導致生物炭結構中的含氧官能團種類和數(shù)量發(fā)生變化而改變其表面的電荷量，進而影響土壤CEC含量（Cui et al.，2016）。類似地，生物炭不僅可以提高有機質含量，還能夠影響土壤中有效磷和速效鉀等養(yǎng)分含量變化（Bhattacharjya et al.，2016；Berihum et al.，2017；Wang et al.，2017），進而在一定程度上影響重金屬形態(tài)轉化。譬如，吳萍萍等（2017）研究表明稻稈生物炭可以顯著提高土壤中有機質含量，且有機質含量與殘渣態(tài)Cd含量變化呈極顯著正相關關系。陳樂等（2020）研究報道稻稈生物炭可以顯著增加土壤速效鉀含量，使其增加了11.9倍，相關性分析表明土壤速效鉀含量與有效態(tài)Cd含量呈極顯著負相關。進一步地，李光炫等（2021）研究表明在生物炭作用下，土壤pH值、速效氮、有效磷和有效鉀等養(yǎng)分含量發(fā)生顯著變化，而這些變化通過影響土壤微生物群落進而改變重金屬形態(tài)，比如土壤 pH 值、速效養(yǎng)分與Actinophytocola、Lentzea、Paenarthrobacter等菌屬呈極顯著正相關，而有效態(tài)Cd則與這些菌屬呈極顯著負相關，同時菌屬的豐度發(fā)生變化，在一定程度上說明土壤 pH值、速效養(yǎng)分等因素在重金屬形態(tài)轉化過程中發(fā)揮著重要的作用。

2.3 生物炭對土壤酶活性的影響

稻稈生物炭作用下，土壤過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性顯著增強，分別提高71.59%、19.62%和27.69%（圖4a—c），在土培過程中，過氧化氫酶活性表現(xiàn)為逐漸上升趨勢，脲酶活性呈現(xiàn)先下降后上升的變化規(guī)律，蔗糖酶活性變化則不顯著。這些酶活性差異可能與酶種類、重金屬形態(tài)和土壤性質有關。吳春艷等（2006）研究表明重金屬Cd對土壤酶活性的抑制效應表現(xiàn)為脲酶>蔗糖酶>過氧化氫酶。于壽娜（2008）研究結果顯示，土壤中交換態(tài)Cd含量越高，脲酶活性越低，而殘渣態(tài)Cd含量越高，脲酶活性越高。有研究報道表明土壤中水分含量的高低會顯著影響過氧化氫酶活性，當pH值在6.5—7.0范圍內時，土壤脲酶活性較高（Kandeler et al.，1997；孟立君等，2004）。重金屬對土壤酶活性的作用機理主要是通過影響構成酶的蛋白分子進而改變酶活性，即激活或者抑制效應。另外，改變土壤酶活性的因素較為復雜，需要綜合考慮土壤微生物群落、土壤養(yǎng)分、植物等多方面的影響（譚向平等，2022）。

圖4 生物炭對土壤酶活性的影響Figure 4 Influence of biochar additions on enzyme activities in soil

2.4 生物炭對土壤微生物群落結構的影響

2.4.1 土壤細菌和真菌多樣性指數(shù)的變化

從OTU水平上，通過Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)來考察生物炭處理后土壤細菌和真菌的 α多樣性。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映了微生物群落的多樣性，Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)反映了微生物群落的豐富度。在生物炭處理后，相較于CK，土壤細菌（圖5a）和真菌（圖5b）Shannon指數(shù)均有所降低，但降幅不大，分別為1.99%和3.13%，而細菌和真菌Simpson指數(shù)均有所提高，增幅分別達到 16.42%和 27.34%。細菌的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均有所下降，降幅分別達到8.78%和8.09%，真菌的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)變化幅度較小。細菌和真菌多樣性指數(shù)的改變，說明生物炭添加后，土壤細菌和真菌群落的多樣性有所增加，而細菌的豐富度有所下降。

圖5 生物炭對微生物多樣性指數(shù)的影響Figure 5 Influence of biochar additions on the diversity indices of microbe in soil

2.4.2 細菌和真菌門水平物種豐度變化

添加稻稈生物炭后，在門水平上，土壤優(yōu)勢細菌群落可分為以下8個類群（相對豐度大于1%）：Proteobacteria（27.76%）、Chloroflexi（21%）、Actinobacteria（15.09%）、Acidobacteria（13%）、Firmicutes（7.98%）、Bacteroidota（6.62%）、Patescibacteria（2.46%）、Gemmatimonadota（3.69%）（圖6a）。生物炭作用后，土壤中 Proteobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadota等細菌豐度減少，而 Chloroflexi、Actinobacteria、Firmicutes、Patescibacteria等豐度增加。類似地，有研究報道Firmicutes是 Cd污染土壤中普遍存在的關鍵門類群之一（Wang et al.，2021）。Wang et al.（2021）等報道了在Cd污染土壤中Bacteroidetes和Firmicutes的豐度顯著增加。黃家慶等（2020）研究表明，生物炭處理對 Cd污染土壤中 Firmicutes、Acidobacteria的豐度影響較小，而顯著增加Chloroflexi的豐度。同樣地，在門水平上，相對豐度大于1%的土壤真菌群落可分為以下4個類群：Ascomycota（63.03%）、Chytridiomycota（19.35%）、Unclassified（9.74%）、Basidiomycota（7.31%）（圖6b）。生物炭處理后，土壤中 Ascomycota、Chytridiomycota、Basidiomycota等真菌豐度下降，Mortierellomycota（1.01%）豐度升高。Wang et al.（2021）報道了在Cd污染土壤中Basidiomycota和Mortierellomycota的豐度顯著增加。

圖6 門水平上土壤優(yōu)勢細菌和真菌的相對豐度變化Figure 6 Relative abundance of soil dominant microbe community at the phylum level

2.4.3 細菌和真菌屬水平物種豐度變化

在屬水平上，土壤細菌可分為15個類群（相對豐度大于1%），主要有：Sphingomonas、Marmoricola、Flavisolibacter、Bacillus、Intrasporangium、Stenotrophobacter、Microvirga、Mycobacterium、Nocardioides、Gemmatimonas、TM7a、Streptomyces、Luteimonas、Tellurimicrobium、Halobacillus等（圖7a）。在重金屬形態(tài)的轉變過程中可能發(fā)揮重要作用的優(yōu)勢菌包括Bacillus和Streptomyces（Sahmoune，2018；Selvin et al.，2009）。類似地，黃家慶等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，在Cd污染土壤中，Streptomyces的豐度變化幅度小。Wang et al.（2021）研究發(fā)現(xiàn)，生物炭可以顯著提高 Cd污染土壤中Bacillus的豐度。同樣地，土壤真菌群落在屬水平上，可分為15個類群（相對豐度大于1%），主要有：Penicillium、Westerdykella、Talaromyces、Fusarium、Thielavia、Curvularia、Saitozyma、Aspergillus、Spizellomyces、Scolecobasidium、Psathyrella、Phoma、Chaetomium、Mortierella、Stachybotrys等（圖7b）。其中，同樣發(fā)現(xiàn)影響重金屬形態(tài)轉變的真菌菌屬，如Aspergillus等豐度發(fā)生變化（Fazli et al.，2015）。以上研究表明，稻稈生物炭的添加可以顯著改變土壤中細菌和真菌群落豐度，這些變化很可能在重金屬Cd形態(tài)轉化過程中發(fā)揮關鍵作用（Zhu et al.，2017）。

圖7 屬水平上土壤優(yōu)勢細菌和真菌的相對豐度變化Figure 7 Relative abundance of soil dominant microbe community at the genus level

2.4.4 土壤細菌和真菌群落與環(huán)境因子的相關性分析

為進一步認識土壤Cd形態(tài)、化學性質、酶活性和優(yōu)勢細菌或真菌的相關性，將其與OTU注釋到的門水平上的10個細菌和真菌類群進行Mantel test分析（圖8）。其中，環(huán)境因子主要包括土壤pH值、CEC、SOM、速效養(yǎng)分（AN、AP、AK）含量、酶活性（過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶）。細菌群落與土壤pH、SOM、AP和AK存在極顯著相關性（P<0.001，R>0.5），而真菌群落與環(huán)境因子之間的相關性不高。本研究進一步對門水平上細菌和真菌各優(yōu)勢類群與環(huán)境因子的關系，進行 Spearman相關性分析（P<0.05），根據(jù)顯著性作出熱圖，見圖9。Heatmap結果表明，在細菌群落中（圖9a），Acidobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadota、Myxococcota等與pH、SOM、AN和AK存在顯著相關性，Others與土壤中各形態(tài)Cd之間存在極顯著關系；而在真菌群落中（圖9b），除AP、CA、UA 之外，Monoblepharomycota、Basidiomycota、Unclassified等與其他環(huán)境因子均存在一定相關性。這些結果表明，細菌群落相較于真菌群落，可能更容易受到環(huán)境因子的影響。進一步說明，稻稈生物炭可以通過影響土壤pH、SOM、AK、土壤酶活性以及功能細菌和真菌菌屬豐度，進而不斷影響 Cd形態(tài)的轉變過程。

圖8 細菌和真菌群落與環(huán)境因子的Mantel test分析Figure 8 Relationships between soil variables and microbial community structures

圖9 門水平上土壤優(yōu)勢微生物類群與環(huán)境因子的Heatmap分析Figure 9 Correlation heat map of bacterial phyla and of fungal phyla with soil properties

3 結論

生物炭對輕度鎘污染稻田土壤修復效果顯著，在降低鎘有效性的同時也改善了土壤環(huán)境，提高土壤中養(yǎng)分含量。本研究通過土培試驗探討了生物炭對Cd形態(tài)含量變化、影響Cd形態(tài)的關鍵因子和土壤細菌、真菌群落結構的變化等。主要結論如下：

（1）稻稈生物炭作用下，土壤酸提取態(tài)和可還原態(tài)Cd含量分別降低23.19%和21.64%，可氧化態(tài)和殘渣態(tài)Cd含量分別提高25.62%和28.62%，這有利于促進重金屬由不穩(wěn)定態(tài)向穩(wěn)定形態(tài)轉變。

（2）稻稈生物炭能夠顯著影響土壤化學性質，包括土壤pH、CEC、SOM和AN、AP、AK等養(yǎng)分含量。RDA分析結果表明，土壤中SOM、AK和pH可能是土壤Cd形態(tài)轉化的關鍵因素。另外，土壤中過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性分別提高71.59%、19.62%和27.69%。

（3）稻稈生物炭可提高土壤中細菌和真菌群落多樣性，改變優(yōu)勢類群的豐度，其中影響重金屬形態(tài)的功能菌種主要包括Bacillus、Streptomyces、Aspergillus等，而且細菌群落相較于真菌群落，可能更容易受到土壤化學性質的影響。