謝葉真，趙學科，宋 昕，徐瑞華，魏夢霞，王 苒，韓雪娜，孫 琳,2，陳亞杰,2，馬琳琳,2，喬佳欣,2，白合林，任景麗，周勝理，王立東

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界多發(fā)惡性腫瘤之一，位居中國癌癥死亡的第四位[1]。我國是世界食管癌高發(fā)國家之一，新增病例數(shù)位于世界前列[2]。近幾年將早期檢測、手術、放化療等運用于食管癌的防治，取得了不錯的成效，但食管癌的預后不良，5 a生存率僅有15%～25%[3]。在中國，97%的食管癌是食管鱗癌，具有顯著高發(fā)區(qū)和家族聚集現(xiàn)象兩大流行病學特征[4]。已有研究表明，食管癌可能是環(huán)境和遺傳相互作用的結(jié)果[5]，其發(fā)生發(fā)展是由多種因素、多個階段、多個過程決定的，環(huán)境是主導，通過基因起作用[6-7]?；蚪M變異是DNA的堿基對改變，包括胚系突變(單核苷酸多態(tài)性，即SNP)和體細胞突變[8-9]。目前，用全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)和全基因組外顯子測序(whole exome sequencing, WES)已發(fā)現(xiàn)了很多促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的體細胞突變[10-11]，但食管癌多發(fā)生在亞種人群，而有關食管鱗癌胚系突變的研究很少，本次實驗以199例高發(fā)區(qū)食管癌患者的癌組織細胞和癌旁組織細胞的全外顯子測序數(shù)據(jù)，運用順式表達數(shù)量性狀基因座的分析方法，得到了與基因表達水平相關的SNP，將其中rs2280851 SNP的3個基因型與199例高發(fā)區(qū)食管癌患者術后總生存期進行生存分析，運用LC-MS/MS蛋白表達定量測得CTR9蛋白表達量，探究食管癌的可疑致病SNP?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

納入的199例患者均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國家重點實驗室50萬例食管癌患者臨床信息數(shù)據(jù)庫[4]，患者均來自于河南省食管癌高發(fā)區(qū)的某市級醫(yī)院，經(jīng)醫(yī)院確診并行手術治療，確診時間為2019年11月至2020年1月。其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)，每位患者對本研究均知情同意，并且此項研究已獲得鄭州大學倫理委員會的批準。

收集199位食管癌患者的癌組織和癌旁組織，均為新鮮組織樣本，在手術切除后30 min內(nèi)進行宏觀解剖，并保存在-80℃下。樣本采集前未接受放化療等其他治療，以半定量的方式對腫瘤細胞進行視覺評分，僅選擇惡性細胞>70%的腫瘤進行全基因組外顯子測序。癌旁正常組織是距腫瘤邊緣至少2 cm遠的鄰近上皮正常組織(生殖系對照)，用于取樣和分子分析。本研究主要通過電話、家訪、村醫(yī)與患者或患者家屬直接聯(lián)系以及通過新合作醫(yī)療數(shù)據(jù)庫、醫(yī)療保障局數(shù)據(jù)庫和公民死亡信息登記管理等系統(tǒng)查詢方式進行隨訪，每0.5 a進行一次隨訪，記錄去世時間和主要死因等。本研究隨訪截止到2021年12月31日，隨訪成功199 例。

1.2 組織樣本的制備

將199例食管癌患者的癌組織和癌旁組織配對，分裝到準備好的已經(jīng)標記的凍存管內(nèi)，樣本編號為001～199號，在樣本類型中，食管癌組織用字母T標記(Tumor)，癌旁正常組織用字母N標記(Normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.3 多組學SNP位點捕獲、檢測與篩選

1.3.1 DNA樣品檢測利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白，RNA污染及其降解程度。并用Qubit 3.0測出DNA樣本濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進行后續(xù)建庫。

1.3.2 建庫捕獲及上機測序采用Agilent液相芯片捕獲系統(tǒng)對人全外顯子區(qū)的DNA進行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進行建庫及捕獲。后在Illumina平臺上進行高通量測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制高通量測序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過轉(zhuǎn)化后形成原始Raw Data測序序列。將原始Raw Data數(shù)據(jù)進行過濾，并且控制平均堿基位置測序錯誤率低于0.1%，樣本的測序reads達到95%以上的對比率，且堿基覆蓋深度達到10×以上時，該點檢測的SNP比較可信。

1.3.4 多組學SNP位點篩選實驗方法為WES(由諾禾致源測序公司進行)，基于WES數(shù)據(jù)中所檢測到的SNP位點，經(jīng)過將正常與癌組織中都有的SNP進行比對，共有62萬個SNP；其中以編碼區(qū)非同義突變、P<0.2為條件篩選出的SNP位點有3 897個；在Mutation表中都存在且生存曲線有差異的有797個位點。

1.4 蛋白表達的測定

采用液相色譜—質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術對199例食管癌的癌組織和癌旁組織樣本進行分析。

2 結(jié)果

2.1 rs2280851 SNP與食管癌患者生存期的關聯(lián)分析

rs2280851與生存期的生存分析曲線表明，rs2280851的A突變?yōu)镚，199例食管癌患者中，有109例G/G基因型個體，54例A/G基因型個體，36例A/A基因型個體；A/A基因型個體生存率顯著高于G/G基因型個體，A/A基因型個體生存率高于A/G基因型個體，A/G基因型個體生存率高于G/G基因型個體(P<0.001)。見圖1。

圖1 3種基因型術后生存分析比較

2.2 rs2280851與CTR9蛋白表達量的關系

eQTL分析表明，eQTL距離調(diào)控基因非常遠，大于20 Mb以上，是通過調(diào)控HHLA1基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子調(diào)控蛋白來介導靶標目的基因的表達。作者做了rs2280851與CTR9蛋白表達量關系的研究。相對于rs2280851的參考型A/A，突變型G/G型蛋白表達量最少，rs2280851突變后，通過調(diào)控HHLA1基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子，顯著降低CTR9的表達。見圖2。

圖2 rs2280851的3種基因型CTR9蛋白表達

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，我國食管癌主要是鱗癌[12]，高發(fā)于河南、山西、太行山、閩粵等地區(qū)[13]。食管癌是環(huán)境和遺傳長期相互作用的結(jié)果，有關研究已發(fā)現(xiàn)p53、BRCA2等基因與食管癌相關[14-15]，但是所用方法通量低，不能鑒別易感基因和變異位點。以高通量方法，系統(tǒng)地闡明食管癌相關候選基因非常必要。本實驗對199例高發(fā)區(qū)食管鱗癌患者進行全外顯子測序，通過樣本檢測、數(shù)據(jù)質(zhì)控及與患者術后生存期進行生存分析，發(fā)現(xiàn)rs2280851位點突變型G/G對食管鱗癌患者的生存影響較大，為可疑致病SNP。通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找，rs2280851位點關聯(lián)的基因為HLLA1。通過LC-MS/MS蛋白表達定量和eQTL相關分析，發(fā)現(xiàn)本組患者SNP rs2280851等位基因G的攜帶量與CTR9蛋白的表達呈負相關。

rs2280851 SNP影響HLLA1所調(diào)控的CTR9蛋白的表達，rs2280851 SNP與食管癌患者的生存預后相關。正常人與HLLA1基因相關的rs2280851的堿基是A，當A突變后，CTR9蛋白的表達量降低，但預后變差。由此可見，HLLA1基因SNP rs2280851G/G型可能是致病SNP。已有研究表明，CTR9是PAF1復合物重要的組成蛋白，PAF1在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄時起到輔助功能，參與染色質(zhì)中組蛋白的甲基化修飾，在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄延伸中發(fā)揮功能[16]。另外一個重要的蛋白是paf1，paf1和ctr9的突變會致癌或促進癌相關疾病的發(fā)展[17]?，F(xiàn)有研究表明CTR9蛋白在肝癌患者的腫瘤組織中表達上調(diào)，CTR9的下調(diào)顯著降低了肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移[18]。

目前普遍認為食管癌的發(fā)生機制是環(huán)境—基因—遺傳相互作用，高發(fā)區(qū)是環(huán)境因素，高發(fā)區(qū)食管癌患者術后生存期低，可能與HLLA1基因的SNP rs2280851 A突變?yōu)镚，CTR9蛋白表達降低有關。本研究運用全外顯子測序技術和LC-MS/MS蛋白表達定量，首次提出SNPrs2280851對應的基因HLLA1的突變型GG是食管癌變的重要分子事件，提示HLLA1可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關。同時為“環(huán)境-遺傳-基因互作”食管癌變機制提供了新的證據(jù)和高危人群分子分型標記，有利于預警篩查早期發(fā)現(xiàn)和防治食管癌高危人群，確定用于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和個體化的分子靶標，為進一步建立食管癌高危人群預警篩查、早期發(fā)現(xiàn)和防治提供理論和技術支撐。