賈瑞諾，許冰怡，高社干，2

腫瘤發(fā)生是遺傳和表觀遺傳學多重改變的結果[1]。遺傳改變包括染色體數(shù)目和結構變化，基因擴增、缺失和突變。表觀遺傳改變包括組蛋白修飾和DNA甲基化狀態(tài)的改變，以及非編碼RNA調(diào)控的改變等。遺傳和表觀遺傳改變相互依存致使腫瘤發(fā)生發(fā)展，如基因改變可引起表觀遺傳改變導致異常染色質(zhì)調(diào)節(jié)。全基因組系統(tǒng)分析顯示，組蛋白修飾酶(包括去甲基化酶)在多種類型腫瘤中高頻[2-4]，組蛋白甲基化和去甲基化之間的不平衡致使腫瘤發(fā)生[5-6]，其核心是組蛋白酶修飾失調(diào)。毋庸置疑，更好地理解基因組和表遺傳學改變之間復雜的關系，對于認識腫瘤發(fā)生和發(fā)現(xiàn)新的預后分子標志物和治療靶點至關重要。

2000年，Yang等從低分化食管鱗狀細胞癌(esophageal Squamous cell cancer,ESCC)細胞系KYSE-150擴增區(qū)域9p24克隆出一高頻擴增基因：鱗狀細胞癌擴增基因1(gene amplified in squamous cell carcinoma 1,GASC1)，又稱KDM4C[2]。隨后研究發(fā)現(xiàn)GASC1在多種腫瘤中擴增和過表達，并且其表達上調(diào)與患者不良預后相關[3-9]。最近，GASC1蛋白已被確定為JMJD2(jumonji domain containing 2)家族成員之一。JMJD2為一組新發(fā)現(xiàn)具有轉錄調(diào)節(jié)功能的組蛋白賴氨酸去甲基化酶[10-13]，而后者在調(diào)節(jié)基因表達和染色質(zhì)構架中起重要作用，并由此影響個體生長發(fā)育、DNA修復，干細胞生物學行為及腫瘤發(fā)生。尤其是組蛋白去甲基化酶，如GASC1，不僅在癌變過程中發(fā)揮重要作用，其抑制劑也顯示出較強的抗腫瘤能力，在腫瘤靶向治療方面極富前景[14-18]。

本文將從以下內(nèi)容綜述：組蛋白去甲基化酶GASC1在多種腫瘤中的基因改變；GASC1通過介導組蛋白修飾表觀遺傳學改變促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機制；GASC1抑制劑的研發(fā)鑒定，以及其在抗腫瘤治療中的優(yōu)勢及不足。

1 GASC1：食管癌9p24基因擴增區(qū)域

基因擴增是人類癌基因激活的重要機制之一，導致其RNA及蛋白過表達[19- 20]。Yang等[2]最初應用比較基因組雜交法分析人食管癌細胞系，發(fā)現(xiàn)9p24存在擴展區(qū)域。經(jīng)過檢測29個食管癌細胞株，5個KYSE150細胞株(17.2%)被發(fā)現(xiàn)存在GASC1擴增。KYSE150是從一位49歲患者的低分化進展期食管鱗狀細胞癌培養(yǎng)建立的食管癌細胞系，其在9p23-24區(qū)域表現(xiàn)高水平的擴增[2,22]。由于基因擴增區(qū)域經(jīng)常是癌基因或某些腫瘤相關基因的“安樂窩”，并且9p23-24擴增已報道在多種腫瘤中發(fā)生，研究者應用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和DNA印跡(southern blot)分析9p23-24擴增區(qū)域，利用Northern印跡法檢測該擴增區(qū)的靶基因或轉錄子，表達序列標簽克隆(expressed sequence tag,EST)R24542被發(fā)現(xiàn)在食管癌細胞系過表達，并在9p23-24區(qū)域擴增。應用R24542克隆作為探針在兩個不同的cDNA文庫篩選，新基因GASC1被成功克隆[2]。

2 GASC1在多種腫瘤擴增和過表達

GASC1在多種腫瘤擴增和高表達，包括淋巴瘤、髓母細胞瘤、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等[3-9]。Yang等對一系列乳腺癌細胞系和原發(fā)乳腺癌樣本進行了全基因組分析，在50例乳腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)7例GASC1擴增，包括HCC1954、Colo824、SUM149、 HCC70、HCC38、 HCC2157、MDA-MB-436[3-4,11,23]，大約15%原發(fā)乳腺癌組織發(fā)現(xiàn)該基因擴增[3,11]。7例GASC1擴增細胞系均為侵襲性強、預后極差的基底型乳腺癌亞型[23]。另一研究顯示，116例基底型乳腺癌組織相比于83例非基底型乳腺癌組織，GASC1轉錄表達水平明顯增高[3,24]。在35%～45%原發(fā)性縱隔B細胞淋巴瘤(primary mediastinal B cell lymphoma，PMBL)及33%的霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)中也檢測到GASC1擴增和/或高表達[25]，7.3%髓母細胞瘤發(fā)現(xiàn)GASC1擴增[4]。Italiano等利用細胞遺傳學、FISH及CGH分析了1例轉移性肺肉瘤樣癌，在原發(fā)灶及兩個不同部位的轉移灶同時發(fā)現(xiàn)GASC1的擴增，表明GASC1是該病例腫瘤發(fā)生機制的重要組成部分[9]。

為進一步證實GASC1在不同腫瘤中的擴增情況，Yang等調(diào)查CGH陣列數(shù)據(jù)庫，收集了多種癌癥類型3 131個拷貝數(shù)圖譜[26]。在3 131個腫瘤樣本中，11.5%存在GASC1擴增，其中2.87%表現(xiàn)為GASC1基因局灶性擴增峰值，特別在乳腺癌和肺癌。基于癌癥基因組鑒定重要靶點(genomic identification of significant targets in cancer，GISTIC)，243例乳腺癌標本有15.64%GASC1擴增，其中4.53%高水平擴增。在774例肺癌組織標本中13.44% GASC1擴增。在其他腫瘤中也頻發(fā)出現(xiàn)GASC1擴增，如食管鱗狀細胞癌20.45%，卵巢癌19.42%，大腸癌19.25%。見表1。另有報道顯示，相對于正常前列腺組織，GASC1在前列腺癌組織中顯著過表達[10,27]。

3 GASC1的惡性轉化潛能

GASC1在多種細胞模型表現(xiàn)具有惡性轉化潛能。為證實GASC1可否引起人正常乳腺上皮細胞惡性表型轉化，野生型GASC1經(jīng)慢病毒包裝轉染正常乳腺上皮細胞MCF10A，結果顯示GASC1過表達導致細胞獲得惡性轉化表型，包括生長因子非依賴性生長和懸浮成球培養(yǎng)陽性[3]。在人工基膜Matrigel三維立體培養(yǎng)形態(tài)形成實驗中，MCF10A細胞形成具有極性特征、有限生長、空腔樣正常類腺泡樣結構；而MCF10A-GASC1細胞則多呈異常腺泡樣的實性內(nèi)腔結構[3]。這些結果表明，GASC1過度表達可妨礙上皮細胞正常組織結構，而這種現(xiàn)象是腫瘤形成始動階段的常見改變。

利用基因敲除方法證實GASC1對于乳腺癌、食管癌、前列腺癌和淋巴瘤等多種腫瘤表型維持起重要作用。在GASC1擴增乳腺癌細胞系HCC1954、Colo824和SUM149，利用GIPZ表達阻滯shRNA慢病毒系統(tǒng)穩(wěn)定敲除GASC1表達，與MCF10A細胞相比，敲除GASC1可顯著抑制乳腺癌細胞增殖及克隆形成[3]。利用相同方法顯示敲除GASC1同樣抑制食管癌細胞KYS150增殖及克隆形成[10]。在前列腺癌，GASC1與雄激素受體(androgen receptor，AR)相互作用，是AR誘導轉錄的共激活子，利用shRNA下調(diào)GASC1表達可抑制雄激素依賴性前列腺癌細胞增殖[28]。前文提及，淋巴瘤尤其是PMBL a和HL，9p24區(qū)域呈高頻擴增。為識別這一擴增區(qū)域的癌基因，Rui等在PMBL和HL中利用RNA干擾篩查了9p24擴增區(qū)域功能性關鍵基因。他們發(fā)現(xiàn)GASC1和JAK2共同維持淋巴瘤細胞增殖和存活[25]?？傊珿ASC1作為癌基因在多種類型腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

4 GASC1催化組蛋白去甲基化

染色質(zhì)修飾作為表觀遺傳調(diào)控的重要機制，成為近幾年的研究熱點，組蛋白修飾異常調(diào)節(jié)與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[1,6]。染色質(zhì)基本單位是核小體，其由147bpDNA堿基以不斷重復的核小體核心：4對組蛋白H2A、H2B、H3和H4為軸心盤繞而成。這些組蛋白呈球形，但有一包含了大量轉錄后修飾的N末端。組蛋白末端修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化及異構化，從而結合蛋白標志，被稱為組蛋白密碼[29]。組蛋白賴氨酸甲基化受組蛋白甲基轉移酶和去甲基化酶動態(tài)活化所調(diào)控，其作為主要染色質(zhì)調(diào)控機制影響著根本的核轉錄過程，并在轉錄后調(diào)控中起核心作用[15,29]。不同賴氨酸殘基的甲基化、同一賴氨酸殘基的甲基化程度以及在特殊基因位點的組蛋白甲基化，將導致不同的轉錄和生理后果。研究顯示在組蛋白H3的5個位點上(K4、K9、K27、K36、K79)發(fā)生賴氨酸甲基化對基因轉錄有明顯影響[15-16,30]。一般來說，H3K4、H3K36和H3K79甲基化與轉錄激活相關，而H3K9和H3K27的甲基化(H3K9me3/me2)(H3K27me3/me2)與轉錄抑制相關[30]。

GASC1于2000年最初被克隆時，其被預測可能是一種介導染色質(zhì)轉錄調(diào)控的核蛋白，但并不清楚其作用機理，包括在正常細胞和腫瘤細胞中如何調(diào)控轉錄。2004年，Katoh等確定GASC1屬于Jumonji亞家族JMJD2成員之一[31]。該研究定義GASC1為JMJD2C，含有一個Jumonji(Jmj)C結構域，一個JmjN結構域，兩個植物同源結構域(plant homeo domain，PHD)型鋅指和兩個Tudor結構域。2006年，隨著對JmjC結構域蛋白的鑒定，人們在理解染色質(zhì)調(diào)節(jié)機制方面出現(xiàn)新的突破，包括對GASC1的認識，明確其為一種新的組蛋白去甲基化酶[10,13,32]。2007年，GASC1被命名為KDM4C(lysine-specific demethylase 4C)[33]。JmjC家族由30個同源子組成，18個已明確具有組蛋白去甲基化酶活性，并進一步分為7個亞家族(kdm2-8)[15]。人類KDM4亞家族有6個成員(KDM4A-F)，其中2個成員KDM4E/F，可能是假基因[31]。KDM4A、B和C(GASC1)蛋白，有超過50%序列同源性，包含JmjN、JmjC、PHD和Tudor結構域，但KDM4A缺乏羧基端PHD和Tudor結構域。見圖1。

圖1 GASC1及其同源子KDM4A、B和D結構域的位置和長度(基于美國國家生物技術信息中心NCBI數(shù)據(jù))

GASC1N-末端的Jumonji域是組蛋白去甲基化酶的催化核心[10,13,32]。Jumonji，在日文中名“十字”，人們將在小鼠體內(nèi)可引起神經(jīng)板消融變性形成酷似十字狀的這類轉錄因子命名為Jumonji[34]。根據(jù)在蛋白中的相對位置，JmjN和JmjC被認為是Jumonji蛋白中的保守序列[35-37]。JmjC結構域是GASC1作為組蛋白去甲基化酶的催化域，JmjN提供和JmjC形成廣泛相互作用的完整結構[12,14,32]。JmjC及JmjN是所有含JmjC結構域蛋白(包括GASC1)實現(xiàn)去甲基化的基本功能單位[12]。GASC1 Jumonji結構域介導的去甲基反應是雙加氧反應，依賴Fe(Ⅱ)和a-酮戊二酸(a-ketoglutarate，a-KG)作為共刺激因子參與，見圖2。體外及細胞學研究顯示，GASC1Jumonji結構域可催化H3K9me3/me2和H3K36me3/me2去甲基[12-14]。綜合結構、生化及細胞研究表明，GASC1可催化H3K9me3/me2去甲基化(H3K9me3/me2減少4～5倍)，并有效減少H3K36me3/me2底物[38]。酶底物競爭性試驗顯示GASC1對H3K9三甲基多肽的結合明顯優(yōu)于二甲基[38]。GASC1催化域(1-347aa)的晶體結構可以在Protein Data Bank (PDB)數(shù)據(jù)庫查獲(2XML)。體外生化及細胞學分析顯示，GASC1JmiC結構域的H190、E192及H288殘基是組成Fe(Ⅱ)結合槽的基本單位，H190和E192突變可明顯降低H3K9去甲基化活性[10]。因此，GASC1的Jumonji結構域主要使H3K9me3去甲基化，其C-端PHD和Tudor域可能有助于GASC1有效的核定位和介導GASC1與組蛋白和其他蛋白質(zhì)結合[39]。然而，亞基PHD和Tudor域在GASC1依賴的染色質(zhì)調(diào)控機制中的確切作用仍不明了。

5 GASC1參與腫瘤生成的分子機制

H3K9和H3K36二甲基和三甲基是調(diào)控轉錄和其他生物進程的重要標志，因此推測GASC1表達異?？蓪е陆M蛋白甲基化途徑失衡，影響轉錄過程中核染色質(zhì)調(diào)控、DNA修復、染色體穩(wěn)定性，這些均為腫瘤發(fā)生最相關的分子機制。GASC1通過H3K9去甲基化作用可上調(diào)重要癌基因MDM2和myc表達，以及干細胞關鍵轉錄因子NANOG[3,25,40-42]。Ishimura等利用小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)尋找GASC1調(diào)控下游靶基因[40]，外源性過表達GASC1在MEF細胞，發(fā)現(xiàn)MDM2 mRNA和蛋白水平表達增加，染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析示GASC1被招募到MDM2基因啟動子區(qū)P2，致MDM2的H3K9me3/me2去甲基化，但該研究沒有檢測到隨著GASC1過表達，MDM2 P2啟動子H3K36me3水平變化。利用siRNA敲除GASC1表達可引起MDM2表達下調(diào)。Wissmann等首次確定GASC1作為H3去甲基化酶調(diào)節(jié)AR功能[28]，通過體外和體內(nèi)GASC1與AR結合試驗、組裝AR配體使GASC1結合AR啟動子，結果導致H3K9me3去甲基化，使雄激素受體依賴的轉錄上調(diào)。相反，GASC1敲除可抑制雄激素H3K9me3去甲基化和轉錄激活。Rui等研究發(fā)現(xiàn)，在淋巴瘤細胞敲除GASC1，可通過直接改變myc基因啟動子和內(nèi)含子1區(qū)H3K9me3而抑制myc表達。

腫瘤干細胞(tumor stem cell,TSC)學說認為腫瘤細胞內(nèi)存在著一群“干性”細胞，負責腫瘤生長、轉移和復發(fā)[43-44]。多能胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)H3K9甲基化狀態(tài)就是通過轉錄因子和組蛋白去甲基化酶活性間復雜的相互作用而維持[42,45]。關鍵性轉錄因子，包括OCT4(POU5F1)、NANOG和SOX2，形成一個強大的自動調(diào)節(jié)通路，維持著胚胎干細胞自我更新[46]。GASC1優(yōu)先表達在未分化ESCC[47]。2007年，LOH等明確在小鼠胚胎干細胞，GASC1作為OCT4的靶基因，并識別了NANOG是GASC1靶基因之一：GASC被招募到NANOG啟動子[33]，進一步證實GASC1是胚胎干細胞NANOG基因啟動子區(qū)逆轉H3K9me3所必需的。通過Loss功能研究發(fā)現(xiàn)，GASC1對于胚胎干細胞維護至關重要。上述內(nèi)容提示GASC1作為癌基因，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤干細胞表型參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。但去甲基化酶GASC1在腫瘤干細胞中的作用機制尚需進一步研究，諸多問題等待回答。然而，最近眾多研究支持該假說：GASC1擴增和產(chǎn)物過表達，可誘導組蛋白甲基化表觀遺傳學修飾改變，從而影響在癌生成和人類干細胞維持中起關鍵作用的基因表達。

6 GASC1：極具潛能的靶向治療

組蛋白去甲基化酶包括GASC1在腫瘤發(fā)生過程中，通過表觀遺傳學修飾發(fā)揮關鍵作用，為研發(fā)去甲基化酶抑制劑作為一類新抗癌藥物提供了科學依據(jù)[16-17,48-49]。以GASC1/JMJD2家族組蛋白去甲基化酶三維結構和催化機制研究為基礎，大量JMJD2抑制劑被鑒定和報道，以下主要綜述GASC1抑制劑。

GASC1是Fe(Ⅱ)和a-KG依賴性酶，通過氧化甲基化的組蛋白賴氨酸殘基，從而實現(xiàn)使其去甲基化(圖2)。靶向GASC1激活所必需的輔因子為我們提供了第一個有意義的結果。2006年，Cloos等首次報道了noxalylglycine(NOG)作為a-KG類似物，能夠輕微抑制GASC1對H3K9me3去甲基化的活性[10]，該研究推測NOG作為a-KG的類似物，代替a-KG與GASC1鐵結合殘基結合，而抑制GASC1脫甲基活性。基于GASC1 Jumonji域復合體a-KG的晶體結構模型，Hamada等合成一系列GASC1小分子抑制劑，后命名NCDM-32是選擇性最強的GASC1抑制劑[19,50]，與NOG比較，NCDM-32顯示出非常低微摩爾IC50值，高于NOG500倍的抑制效力[50]。利用生化結構和細胞學分析，Chowdhury等發(fā)現(xiàn)2-羥基戊二酸(2-Hydroxyglutarate，2HG)可抑制a-KG依賴性加氧酶活性，包括GASC1[51]。Methylstat，一種細胞活性選擇性組蛋白去甲基化酶抑制劑，可抑制三甲基賴氨酸去甲基化酶家族成員。這種小分子抑制劑通過一個連接結合含有甲基賴氨酸底物的類似物，即a-KG輔因子模擬物。Methylstat通過抑制GASC1擴增明顯抑制了KYSE150食管癌細胞生長，1/2最大生長抑制濃度(GI50)約為5.1 μM。

利用高通量質(zhì)譜芯片對10萬種以上化合物作為GASC1候選抑制劑篩選，該芯片以小氨基酸多肽為底物，篩選與組蛋白H3共反應前15個氨基酸殘基，并直接檢測底物三甲基Lys9脫甲基形成的二甲基Lys9產(chǎn)物[52]。其中1 126種IC50值小于100 μM化合物被發(fā)現(xiàn)，例如含有8-羥基喹啉(8-hydroxyquinolines，8HQs)核心結構的某些化合物，可以表現(xiàn)出強烈抑制GASC1脫甲基酶活性潛能(IC50：2.1 μM)。8HQs通過結合KDM4A活性位點Fe(Ⅱ)而發(fā)揮抗KDM4去甲基化活性。通過對640個自然產(chǎn)物文庫篩選，Nielsen等利用甲醛脫氫酶方法檢測了21個化合物，發(fā)現(xiàn)咖啡酸為有效GASC1抑制劑[53]?？Х人釣榭寡趸瘎?，既往研究表明其通過影響氧化過程抑制腫瘤細胞生長[54]。最近，一種雜環(huán)系統(tǒng)文庫被用來篩選新GASC1抑制劑，一個4-羥基吡唑支架被認為可能是一種新KDM4C抑制劑[55]。

7 展望與結論

惡性腫瘤既往被視為遺傳性疾病，越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳學修飾在腫瘤發(fā)生的每一個階段起著至關重要的作用，并對其治療產(chǎn)生深遠影響。表觀遺傳學和遺傳學的共同作用與相互關聯(lián)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用日趨明了。GASC1最初在ESCC基因擴增區(qū)域發(fā)現(xiàn)并克隆，至今已被確定為在表觀遺傳組蛋白修飾起關鍵作用的組蛋白賴氨酸去甲基化酶。GASC1在多種惡性腫瘤和體外轉化表型模型中擴增和過表達，但許多重要問題仍未明確，如GASC1依賴的染色質(zhì)修飾轉錄調(diào)控對于腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的分子機制等。進一步理解GASC1對染色質(zhì)組成和轉錄的影響，以及GASC1缺失和過表達對于轉錄和組蛋白修飾的作用，將是決定GASC1全基因靶點的關鍵。研究GASC1在不同腫瘤是否靶向作用于不同基因至關重要。同時，GASC1還可對非組蛋白底物(與H3K9具有相似序列)去甲基化[56-58]。最近研究顯示，GASC1可作用于染色體框同源子4(chromobox homolog 4，CBX4，又名多梳2蛋白，polycomb 2 protein:Pc2)的K191me2脫甲基。CBX4在細胞周期和生長控制方面發(fā)揮重要作用[58]。然而由GASC1介導的組蛋白與非組蛋白去甲基化之間的相互作用未有報道。

基于GASC1在腫瘤發(fā)生中的關鍵作用，GASC1抑制劑有望很快進入臨床試驗。然而，大部分GASC1抑制劑的分子支架來源于其他結構或機制相關的酶或蛋白，因此有時候其可能抑制其他酶家族。另外，許多抑制劑是輔因子和/或底物模擬物，因此對于GASC1特異性抑制作用有限，或不確定。因此，未來的研究中，致力于發(fā)現(xiàn)高選擇性、特異性靶向GASC1的抑制劑至關重要。