鐘潤芳,曹文紅,2,3*,陳忠琴,2,3,何梅芳,高加龍,2,3,章超樺,2,3,秦小明,2,3,鄭惠娜,2,3,林海生,2,3

1(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088) 2(國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋生物制品工程實驗室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江，524088)3(大連工業(yè)大學海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034)

鋅是人體重要的必需微量元素之一,在人體內(nèi)具有多種生物學功能[1-4]。它參與物質(zhì)代謝,對維持機體生理功能和正常代謝起著重要作用。一般情況下,人體對于鋅的吸收和排泄處于動態(tài)平衡狀態(tài),鋅缺乏或過量都會引起多種相關(guān)疾病[5-6],維持這種穩(wěn)態(tài)對于機體代謝至關(guān)重要。食源性鋅的吸收利用情況主要取決于鋅的含量及其生物利用率,而鋅的生物利用率取決于其化學形態(tài);鋅元素在生物體內(nèi)主要以無機鋅和有機鋅的形式存在[7],已有研究表明有機鋅的生物利用率高于無機鋅[8],且鋅與多糖、蛋白結(jié)合后,生物活性增強[9]。因此研究生物體中鋅元素的存在形態(tài),有利于探索其營養(yǎng)價值。

據(jù)《中國食品成分表》顯示,水產(chǎn)品中貝類鋅含量尤為豐富,特別是牡蠣,其含鋅量高達9.39 mg/100 g(生鮮)[10]。目前我國的牡蠣除少部分用于加工成牡蠣高值化產(chǎn)品外,大部分還是直接生鮮食用,不同的烹飪方式不僅能改變食物的質(zhì)地、柔軟度和味道等特征,還可導致牡蠣中不同營養(yǎng)物質(zhì)化學形態(tài)發(fā)生變化,從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[11]。目前關(guān)于牡蠣熱加工處理對鋅元素的影響,主要集中于其總含量的變化,而熱加工對牡蠣中鋅元素的存在形態(tài)、有機鋅結(jié)構(gòu)變化尚未有研究報道。因此本研究選擇蒸制、油炸和烤制3種常見熱加工方式,研究牡蠣經(jīng)過熱加工后鋅元素含量及存在形態(tài)的變化,為牡蠣中鋅元素的營養(yǎng)評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣,購于湛江水產(chǎn)批發(fā)市場,11月份采集,其長度為(12.8±0.6)cm,寬為(6.0±0.4)cm。

食用油,山東魯花集團有限公司;扇貝成分分析標準物質(zhì)(GBW10024),物理地球化學勘查研究所;鋅元素標準溶液,美國Agilent科技公司;本實驗所用試劑除硝酸、過氧化氫為優(yōu)級純外,其余均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PRO4121V756型微波消解儀,奧地利Anton Paar Multiware PRO公司;Thermo M6型火焰原子吸收分光光度計,美國Thermo Fisher公司;FDU551型冷凍干燥機、N-1100V-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化器械株式會社;BRUKER TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀,德國Bruker公司;VOPADEST450型全自動凱式定氮儀,中國廣州德資格哈特儀器有限公司;Cary 60 UV-Vis型分光光度計,美國Agilent公司;T18 digital ULTRA-TURRAX型均質(zhì)機,德國IKA儀器設(shè)備有限公司。

為避免污染,本實驗所用玻璃器皿均經(jīng)過20%硝酸浸泡24 h以上,用自來水、蒸餾水和超純水分別清洗3次,并在使用前保持干燥。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣熱加工處理

牡蠣經(jīng)開殼后,取肉,超純水快速沖洗3遍,隨機分為4組：生鮮組(不經(jīng)熱處理)、蒸制組(100 ℃、10 min)、油炸組(140 ℃、5 min)、烤制組(200 ℃、15 min),其中油炸組以花生油作為介質(zhì),烤制組帶半殼烤箱烤制;冷卻后,使用攪拌機將其勻漿,確保樣品的均一性和代表性,處理后立即冷凍干燥,分袋真空包裝,-20 ℃貯藏備用。

1.3.2 鋅含量的測定

采用微波消解-原子吸收分光光度法測定鋅含量;鋅離子含量采用AAT Bioquest公司的AmpliteTMColorimetric Zinc Ion Quantitation Kit試劑盒測定。

1.3.3 鋅離子的提取

稱取約0.5 g樣品凍干粉,按1∶25料液比加入125 mL超純水,均質(zhì)(8 000 r/min)1 min,離心(8 000 r/min) 10 min,取上清液,沉淀再次重復(fù)2次以上操作,合并上清液并定容至100 mL,用于測定鋅離子的含量。

1.3.4 含鋅多糖組分的提取

稱取約5 g樣品凍干粉,按1∶25料液比加入125 mL超純水,室溫搖床浸提3 h,離心,沉淀再次重復(fù)以上操作,合并上清液,濃縮,Sevag法重復(fù)4次除蛋白,加入4倍體積無水乙醇,4 ℃沉淀14 h,離心收集沉淀,冷凍干燥后粉末即為牡蠣水溶性含鋅粗多糖組分。將上述提取殘渣加入10倍體積的質(zhì)量分數(shù)為3% NaOH,室溫搖床提取2 h,離心,重復(fù)提取1次,上清液用稀鹽酸中和至中性,濃縮,透析(MWCO 3.5 kDa),醇沉,離心收集沉淀,冷凍干燥后粉末即為牡蠣堿溶性含鋅粗多糖組分。

1.3.5 含鋅蛋白組分的提取

稱取約5 g樣品凍干粉,按1∶25料液比加入125 mL磷酸鹽緩沖溶液A(0.05 mol/L pH 7.4 PBS),冰浴間歇均質(zhì)1 min,4 ℃搖床提取2 h,離心,收集上清液,沉淀再次加入125 mL磷酸鹽緩沖溶液A,共重復(fù)提取3次,合并上清液,飽和硫酸銨沉淀蛋白,靜置過夜,離心,沉淀復(fù)溶,透析除鹽(MWCO 3.5 kDa),冷凍干燥后粉末即為水溶性含鋅粗蛋白組分。將上述提取殘渣加入125 mL磷酸鹽緩沖溶液B(0.1 mol/L pH 7.4 PBS,I=1.0 NaCl)混勻,4 ℃搖床提取10 h,離心,收集上清液,沉淀再次加入125 mL磷酸鹽緩沖溶液B,重復(fù)提取2次,合并上清液,飽和硫酸銨沉淀蛋白,靜置過夜,離心,沉淀復(fù)溶,透析除鹽(MWCO 3.5 kDa),冷凍干燥后粉末即為鹽溶性含鋅粗蛋白組分。整個提取過程均在低溫下進行,防止蛋白質(zhì)發(fā)生變性。

1.3.6 多糖和蛋白含量測定

采用GB/T 9695.31—2008苯酚-硫酸法測定總糖含量;GB 5009.5—2016凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 多糖及蛋白的傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)分析

取經(jīng)凍干的含鋅粗多糖組分及含鋅粗蛋白組分樣品約1～2 mg,分別與烘干的200 mg KBr在干燥的環(huán)境下充分研磨混勻,模具中壓片,通過FTIR在4 000～400 cm-1處進行掃描,采用OPUS軟件對所得的紅外光譜圖進行初步分析。蛋白質(zhì)紅外圖譜的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)運用Peakfit Version 4.12軟件進行基線校正,Gaussian去卷積,再用二階導數(shù)圖譜進行高斯曲線擬合,通過軟件自動多次擬合,使殘差達到最小;再根據(jù)各子峰與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系,計算各子峰面積占總面積的比率,得出蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次以上,采用Excel、Origin 2021、GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)及作圖,方差分析(One-Way ANOVA,P<0.05)和Duncan的多重檢驗用于確定樣本之間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱加工對牡蠣總鋅含量的影響

經(jīng)熱加工后牡蠣中總鋅含量的變化如圖1所示,未經(jīng)熱加工的生鮮組其鋅含量為1 654.80 μg/g(干基,下同),與BILANDZIC等[12]測定的牡蠣鋅含量結(jié)果一致;蒸制和油炸處理后,鋅含量較生鮮牡蠣顯著降低(P<0.05),且油炸處理后鋅含量顯著低于蒸制處理;而烤制后的牡蠣鋅含量與其生鮮含量無顯著差異(P>0.05)。造成該結(jié)果可能是由于熱加工過程中產(chǎn)生流失液,鋅元素也伴隨著損失,其中油炸組加工較為劇烈,牡蠣中化學成分發(fā)生較大變化,從而鋅含量變化較顯著。HOSSEINI等[13]研究發(fā)現(xiàn)里海白魚經(jīng)微波、煮沸、烘烤和油炸4種加工方式,其鋅含量都發(fā)生減少,其中煮沸使鋅含量顯著降低。MNARI等[14]發(fā)現(xiàn)鯛魚經(jīng)蒸、煮、烤、炸熱加工方式均使鋅含量減少,其中油炸對礦物質(zhì)的損失最顯著,與本實驗結(jié)果一致。

圖1 熱加工對牡蠣總鋅及鋅離子含量的影響Fig.1 Effects of thermal processing on the content of total zinc and zinc ion in oysters注：不同字母表示同一類別組間具有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.2 熱加工對牡蠣鋅離子含量的影響

牡蠣經(jīng)熱加工后其鋅離子含量的變化如圖1所示,熱加工均使鋅離子的含量極顯著降低(P<0.01),且油炸處理后鋅離子含量顯著低于蒸煮和烤制處理;鋅離子占總鋅含量也隨熱加工發(fā)生變化,蒸制、油炸和烤制處理均使牡蠣中鋅離子含量占比降低。結(jié)果表明,熱加工使牡蠣中總鋅、鋅離子含量及鋅離子所占比例均降低,可能是因為熱加工使鋅離子伴隨流失液產(chǎn)生損失,且熱加工使蛋白、多糖等有機物發(fā)生變性,破壞有機物結(jié)構(gòu),形成不溶性成分[15],影響鋅元素的吸附和化學鍵結(jié)合狀態(tài),使鋅離子被包裹或結(jié)合,導致鋅離子的含量降低。

2.3 熱加工對牡蠣多糖鋅的影響

牡蠣經(jīng)過熱加工后,進行分級提取水溶多糖及堿溶多糖,研究多糖中鋅含量變化。結(jié)果如表1所示,牡蠣多糖主要為水溶多糖,含量為(130.7±2.75)mg/g;熱加工后牡蠣中水溶多糖及堿溶多糖更易于提取,蒸制、油炸和烤制后水溶多糖的含量顯著高于生鮮牡蠣(P<0.05),烤制后堿溶多糖的含量顯著高于其他熱加工方式和生鮮牡蠣(P<0.05);相反的,熱加工后水溶多糖的鋅含量顯著減少,且蒸制組和油炸組較烤制組顯著降低,而堿溶多糖鋅含量隨著多糖含量的升高而升高。(鋅/多糖)值可反映多糖與鋅的結(jié)合率,(鋅/多糖)值越高,說明多糖結(jié)合的鋅含量越高。從圖2可知,生鮮組堿溶多糖的鋅結(jié)合量高于水溶多糖約9倍,說明多糖中堿溶多糖是鋅結(jié)合的主體,結(jié)合率可達(39.92±2.5)μg/mg。熱加工后,水溶和堿溶多糖的鋅結(jié)合量都顯著下降(P<0.05),對于水溶多糖,蒸制組鋅結(jié)合率下降74.51%,油炸組下降71.93%,烤制組下降60.13%;對于堿溶多糖,蒸制組鋅結(jié)合率下降28.06%,油炸組下降37.95%,烤制組下降55.26%,可推測牡蠣中多糖鋅經(jīng)過熱加工后,鋅離子發(fā)生脫落,且伴隨流失液損失。

表1 熱加工對牡蠣多糖及鋅含量的影響Table 1 Effects of thermal processing on oyster polysaccharide and zinc content

圖2 熱加工對牡蠣多糖鋅含量的影響Fig.2 Effects of thermal processing on the content of polysaccharide zinc in oysters

熱加工對多糖鋅結(jié)構(gòu)的影響鮮有報道,但有研究發(fā)現(xiàn),高溫處理對多糖的分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生一定的影響;ELIYAS等[16]研究發(fā)現(xiàn)不同的提取溫度會導致蛹蟲草多糖的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。LI等[17]研究熱處理對灰樹花水溶多糖的影響,結(jié)果表明熱處理使多糖發(fā)生降解,(1→3,4) α-D-糖苷鍵含量顯著減少,其分支程度降低。由此可推測,熱加工對多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,進而影響多糖與鋅的結(jié)合,使其結(jié)合率下降。

2.4 熱加工對牡蠣蛋白鋅的影響

牡蠣經(jīng)過熱加工后,分級提取水溶蛋白及鹽溶蛋白,研究蛋白中鋅含量的變化。結(jié)果如表2所示,經(jīng)熱加工后,水溶蛋白及鹽溶蛋白的提取含量較生鮮組顯著下降(P<0.05),鋅的含量也顯著減少(P<0.05),可能是由于蛋白發(fā)生熱變性,使其溶解度下降[18];圖3顯示,生鮮狀態(tài)下牡蠣的水溶蛋白鋅結(jié)合率為(3.88±0.92)μg/mg,經(jīng)過熱加工后(鋅/蛋白)值極顯著降低(P<0.01),蒸制組水溶蛋白鋅結(jié)合率下降73.68%,油炸組下降74.38%,烤制組下降64.25%;而對于鹽溶蛋白,鋅結(jié)合含量幾乎不受熱加工的影響。

目前對于蛋白鋅的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)的測定[19],而熱加工對蛋白鋅的影響尚未有研究報道。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對環(huán)境條件敏感,溫度的升高,會造成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化,如局部展開、疏水性增加、等電點變化等;維持蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的鍵在熱處理過程中被削弱,導致蛋白質(zhì)疏水部位變性和暴露[20]。LI等[21]采用100 ℃處理牡蠣鐵蛋白,研究發(fā)現(xiàn)熱處理導致鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)遭到破壞,引起鐵蛋白的聚集和變性。因此可推測,熱加工造成牡蠣中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,進而影響蛋白與鋅的結(jié)合。

表2 熱加工對牡蠣蛋白及鋅含量的影響Table 2 Effects of thermal processing on oyster protein and zinc content

圖3 熱加工對牡蠣蛋白鋅含量的影響Fig.3 Effects of thermal processing on the zinc content of oyster protein

2.5 熱加工對牡蠣含鋅多糖及蛋白紅外分析

a-水溶多糖;b-堿溶多糖;c-水溶蛋白;d-鹽溶蛋白A為生鮮組;B為蒸制組;C為油炸組;D為烤制組圖4 熱加工處理后牡蠣多糖及蛋白的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of polysaccharides and proteins after thermal processing

蛋白質(zhì)的FT-IR圖譜中,酰胺Ⅰ帶的峰型受蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)影響,其中1 646～1 664 cm-1為α-螺旋特征峰,1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊特征峰,1 664～1 681 cm-1為β-轉(zhuǎn)角特征峰,1 637～1 645 cm-1為無規(guī)卷曲特征峰[24]。圖5為生鮮狀態(tài)下牡蠣水溶蛋白及鹽溶蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖,結(jié)合圖6可發(fā)現(xiàn),牡蠣水溶及鹽溶蛋白中不存在無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。對比生鮮組,經(jīng)過熱加工牡蠣的水溶蛋白中α-螺旋含量伴隨著熱加工溫度的升高而升高;而β-折疊及β-轉(zhuǎn)角含量隨著熱加工的溫度升高而逐漸降低,說明熱加工使β-折疊及β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,而β-折疊結(jié)構(gòu)由于氫鍵的作用存在于蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)[25],β-折疊結(jié)構(gòu)含量的降低可推測蛋白質(zhì)的氫鍵斷裂,與圖4-c水溶蛋白的紅外光譜圖3 700～3 200 cm-1吸收峰處的變化相對應(yīng);熱加工對鹽溶蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生影響,油炸組各結(jié)構(gòu)的含量占比與生鮮組基本相似,蒸煮組與烤制組的各結(jié)構(gòu)含量占比相似,蒸制及烤制處理后鹽溶蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變,有研究報道,長時間熱處理會造成7S球蛋白α’亞基和α亞基構(gòu)成熱聚集體,且熱聚集體中β-折疊結(jié)構(gòu)易向β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[26]。熱加工處理可能使鹽溶蛋白產(chǎn)生熱聚集體,從而使α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多。

a-水溶蛋白;b-鹽溶蛋白圖5 生鮮狀態(tài)下牡蠣蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖Fig.5 Gaussian curve fitting of amideⅠof oyster proteins in fresh state

a-水溶蛋白;b-鹽溶蛋白圖6 不同熱加工牡蠣蛋白二級結(jié)構(gòu)的含量Fig.6 Estimated secondary structures of oyster proteins subjected to different heat-processed

以上結(jié)果表明,熱加工使牡蠣中水溶蛋白及鹽溶蛋白結(jié)構(gòu)遭受破壞,且蛋白的鋅結(jié)合率下降,推測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及化學鍵的變化影響鋅元素的結(jié)合狀態(tài),造成鋅元素的損失,由于結(jié)構(gòu)分析實驗所用多糖鋅及蛋白鋅純度不高,對于多糖與蛋白的鋅結(jié)合鍵的影響,有待進一步的研究。

3 結(jié)論

食物中鋅元素的存在形態(tài)與其營養(yǎng)價值密切相關(guān)。本研究探討蒸制、油炸和烤制3種熱加工處理對牡蠣中鋅元素存在形態(tài)的影響。結(jié)果顯示：牡蠣經(jīng)熱加工后,總鋅含量及鋅離子含量具有不同程度地下降。蒸制過程總鋅含量損失6.43%,鋅離子含量下降45.60%;油炸過程總鋅含量損失14.68%,鋅離子含量下降68.12%;烤制過程總鋅含量未發(fā)生明顯變化,但鋅離子含量下降50.59%。熱加工使多糖和蛋白的鋅結(jié)合能力顯著下降,經(jīng)蒸制、油炸、烤制后水溶多糖的鋅結(jié)合率分別下降74.51%、71.93%、60.13%;堿溶多糖鋅結(jié)合率分別下降28.06%、37.95%、55.26%;水溶蛋白的鋅結(jié)合率分別下降73.68%、74.38%、64.25%;而對于鹽溶蛋白,鋅結(jié)合含量幾乎不受熱加工的影響。紅外光譜圖顯示,多糖的官能團及化學鍵沒有明顯變化,進一步推測牡蠣多糖是通過吸附的方式與鋅結(jié)合,熱加工后,破壞其吸附作用使鋅脫落;蛋白的紅外光譜分析表明,熱加工使蛋白的官能團及二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,推測蛋白的空間結(jié)構(gòu)及化學鍵的變化影響鋅元素的結(jié)合狀態(tài),造成鋅元素的損失。