楊斌，葛迎春，吉冬梅，李蓉

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期常見的并發(fā)癥，表現(xiàn)為妊娠期首次發(fā)生的糖尿病及糖耐量異常，一方面危害孕婦及胎兒的健康，另一方面增加孕婦遠(yuǎn)期發(fā)生糖代謝異常及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。胰島素抵抗是與GDM發(fā)病及未來發(fā)展為產(chǎn)后糖代謝異常密切相關(guān)的病理生理機(jī)制，母體血液循環(huán)中的多種激素、細(xì)胞因子均會影響胰島素生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。胎盤和內(nèi)臟脂肪組織具有極強(qiáng)的內(nèi)分泌功能，是孕期母體血液循環(huán)中激素和細(xì)胞因子的重要來源，研究胎盤和內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)分泌特征的變化是近些年探究GDM發(fā)病機(jī)制的熱門靶點(diǎn)。

高遷移率族蛋白 B1(high mobility group box 1，HMGB1)是參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的細(xì)胞因子，有研究報(bào)道GDM和2型糖尿病患者血清中HMGB1的含量均明顯升高且與胰島素抵抗程度相關(guān)[3-4]，提示HMGB1的過度分泌可能與胰島素抵抗的產(chǎn)生或加重有關(guān)，進(jìn)而可能參與GDM及2型糖尿病的發(fā)病。脂肪和胎盤均表達(dá)HMGB1，但GDM發(fā)病過程中脂肪和胎盤中HMGB1所起的作用尚不完全清楚。因此，本研究將收集胎盤組織和大網(wǎng)膜脂肪組織，圍繞HMBG1表達(dá)的變化展開研究，通過對照研究及相關(guān)性分析來闡明HMGB1表達(dá)與GDM患者胰島素抵抗程度及產(chǎn)后糖代謝異常的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2018年1月至2020年3月在海安市中醫(yī)院診斷為GDM并接受剖宮產(chǎn)的58例患者作為GDM組，入組標(biāo)準(zhǔn)：① 孕24～28周時(shí)接受口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)，符合GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；② 孕期進(jìn)行飲食控制、運(yùn)動(dòng)鍛煉控制血糖；③ 符合剖宮產(chǎn)指征并行剖宮產(chǎn)，剖宮產(chǎn)當(dāng)天留取外周靜脈血，術(shù)中留取大網(wǎng)膜脂肪組織，術(shù)后留取胎盤組織；④ 產(chǎn)后6～8周門診復(fù)診。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 孕前患有糖尿?。虎?合并子癇前期、肝內(nèi)膽汁淤積等其他妊娠期并發(fā)癥；③ 孕期接受胰島素治療。另取同期在我院產(chǎn)檢并接受剖宮產(chǎn)的60例健康孕婦作為對照組。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，獲得入組對象知情同意。

1.2 臨床樣本收集

剖宮產(chǎn)當(dāng)天抽取空腹肘靜脈血5～6 mL置入含有促凝膠的生化采血管內(nèi)，離心分離血清后放置在-80℃保存；剖宮產(chǎn)術(shù)中，切取大網(wǎng)膜脂肪組織塊、大小約1 cm×1 cm×1 cm，4～5塊，生理鹽水清洗后吸干水分，放置在-80℃保存；剖宮產(chǎn)術(shù)后，在胎盤母體面、臍帶周圍2～3 cm處剪取絨毛組織塊、大小約1 cm×1 cm×1 cm，4～5塊，生理鹽水清洗后吸干水分，放置在-80℃保存。

1.3 胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)的檢測

采用RIPA裂解液對胎盤組織和脂肪組織進(jìn)行勻漿，12 000 r/min、4℃離心10 min，分離上清得到蛋白樣本，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將30 μg蛋白樣本用于western blot檢測。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育PVDF膜1 h，HMGB1抗體(Abcam公司、1∶1 000稀釋)或β-actin抗體(Sigma公司、1∶5 000稀釋)4℃孵育PVDF膜過夜，HRP二抗(Abcam公司、1∶2 000稀釋)室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司)中顯影得到HMGB1及β-actin的條帶，根據(jù)HMGB1與β-actin條帶灰度值的比值計(jì)算HMGB1 的蛋白表達(dá)水平。

1.4 血清指標(biāo)檢測

采用全自動(dòng)生化分析儀(美國羅氏公司)檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，采用電化學(xué)發(fā)光儀(美國羅氏公司)檢測空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，代入公式FBG×FINS/22.5計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)；采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上海西唐公司)檢測HMGB1的含量。

1.5 產(chǎn)后糖代謝異常的隨訪

產(chǎn)后第6～8周時(shí)門診復(fù)診，行OGTT檢查，根據(jù)結(jié)果判斷是否存在產(chǎn)后糖代謝異常，糖代謝異常包括：① 糖尿?。篎BG≥7.0 mmol/L和/或OGTT 2 h血糖≥11.1 mmol/L；② 空腹血糖受損：FBG 6.1～7.0 mmol/L且OGTT 2 h血糖<7.8mmol/L；③ 葡萄糖耐量受損：FBG 6.1～7.0 mmol/L且OGTT 2 h血糖7.8～11.1 mmol/L。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料的比較

GDM組年齡(29.89±6.58)歲，孕前體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(23.44±7.15)kg/m2，孕周(37.84±7.15)周，新生兒體重(3.08±0.62)kg；對照組年齡(27.83±10.93)歲，孕前BMI (22.31±6.88)kg/m2，孕周(38.75±10.12)周，新生兒體重(3.36±0.98)kg。兩組間年齡、孕前BMI、孕周、新生兒體重的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 兩組血清中HMGB1含量、胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平的比較

與對照組比較，GDM組患者剖宮產(chǎn)當(dāng)天血清HMGB1的含量、胎盤及脂肪組織中HMGB1的表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1、圖2及表1。

2.3 GDM組血清中HMGB1含量、胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平的相關(guān)性

GDM組血清中HMGB1含量與胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平均具有正相關(guān)關(guān)系，胎盤組織中HMGB1表達(dá)水平與脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平也具有正相關(guān)關(guān)系，見圖3。

2.4 兩組胰島素抵抗程度的比較

與對照組比較，GDM組患者剖宮產(chǎn)當(dāng)天FINS含量、HOMA-IR水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

2.5 GDM組胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)與胰島素抵抗程度的相關(guān)性

GDM組患者胎盤及脂肪組織中HMGB1的表達(dá)水平與剖宮產(chǎn)當(dāng)天FINS含量、HOMA-IR水平具有正相關(guān)關(guān)系，見下頁圖4。

圖1 兩組胎盤組織中HMGB1的條帶圖

圖2 兩組脂肪組織中HMGB1的條帶圖

表1 兩組血清中HMGB1含量、胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平的比較

注：A:血清HMGB1含量與胎盤組織HMGB1表達(dá)的相關(guān)性；B:血清HMGB1含量與脂肪組織HMGB1表達(dá)的相關(guān)性；C:胎盤組織HMGB1表達(dá)與脂肪組織HMGB1表達(dá)的相關(guān)性。

表2 兩組胰島素抵抗程度的比較

2.6 GDM組中產(chǎn)后糖代謝異?；颊吲c產(chǎn)后糖代謝正?；颊咛ケP及脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平的比較

與GDM組中產(chǎn)后糖代謝正常患者比較，產(chǎn)后糖代謝異常患者胎盤及脂肪組織中HMGB1的表達(dá)水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見下頁圖5、圖6及表3。

注：A:胎盤中HMGB1與FINS的相關(guān)性；B:胎盤中HMGB1與HOMA-IR的相關(guān)性；C:脂肪中HMGB1與FINS的相關(guān)性；D:脂肪中HMGB1與HOMA-IR的相關(guān)性。

圖5 GDM組中產(chǎn)后糖代謝異?；颊吲c產(chǎn)后糖代謝正?；颊咛ケP組織中HMGB1的條帶圖

圖6 GDM組中產(chǎn)后糖代謝異?；颊吲c產(chǎn)后糖代謝正?；颊咧窘M織中HMGB1的條帶圖

表3 GDM組中產(chǎn)后糖代謝異?；颊吲c產(chǎn)后糖代謝正?；颊哐逯蠬MGB1含量、胎盤及脂肪組織中HMGB1表達(dá)水平的比較

3 討論

胰島素抵抗不僅是GDM主要的病理生理特征，也存在于正常妊娠過程。有研究報(bào)道，正常孕婦在孕期的胰島素敏感性下降約50%，胰島素分泌量增加250%；而在GDM的發(fā)病過程中，胰島素抵抗程度較正常孕婦顯著加重[6]。孕期胰島素抵抗的產(chǎn)生與母體炎癥反應(yīng)的激活密切相關(guān)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18、HMGB1等是目前已知在孕期分泌增多且與胰島素抵抗相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者血清中HMGB1、TNF-α、IL-1β、IL-18等的含量明顯增加且與胰島素抵抗程度具有相關(guān)性[7-9]，本研究也發(fā)現(xiàn)GDM患者血清中HMGB1的含量明顯高于正常孕婦。但GDM發(fā)病過程中母體血液循環(huán)中影響胰島素敏感性的炎癥細(xì)胞因子的來源尚不清楚，目前GDM的發(fā)病機(jī)制也未完全闡明。

胎盤和脂肪組織具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌功能，能夠合成多種細(xì)胞因子、激素等并釋放進(jìn)入血液循環(huán)，在妊娠維持、分娩啟動(dòng)、病理妊娠中均起重要作用。胎盤和脂肪組織在GDM的發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用，國外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)GDM的脂肪和胎盤組織中存在炎癥反應(yīng)的過度激活[10-12]。HMGB1是重要的炎癥細(xì)胞因子，本研究發(fā)現(xiàn)GDM孕婦胎盤組織和脂肪組織中HMGB1的表達(dá)水平明顯高于正常孕婦，表明胎盤和脂肪中HMGB1的異常高表達(dá)與GDM的發(fā)病有關(guān)。進(jìn)一步通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：GDM患者胎盤和脂肪中HMGB1的表達(dá)與血清中HMGB1的含量呈正相關(guān)，表明GDM發(fā)病過程中母體血液循環(huán)內(nèi)異常增高的HMGB1可能來源于胎盤和脂肪組織中異常高表達(dá)的HMGB1；同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)胎盤和脂肪中HMGB1的表達(dá)具有正相關(guān)關(guān)系，表明胎盤和脂肪異常高表達(dá)的HMGB1可能存在互相促進(jìn)的作用。

HMBG1對胰島素抵抗有促進(jìn)作用，對胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中胰島素受體底物-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4、蛋白激酶B等的表達(dá)有抑制作用[13-14]。國內(nèi)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，GDM患者脂肪和胎盤組織中存在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的胰島素受體底物-1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4、蛋白激酶B等的表達(dá)均明顯減少[15-16]，表明胎盤和脂肪組織可能在GDM的胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：GDM患者胎盤和脂肪組織中HMBG1的表達(dá)與胰島素抵抗程度呈正相關(guān)，即與FINS含量及HOMA-IR水平呈正相關(guān)，表明胎盤及脂肪組織中異常高表達(dá)的HMGB1在GDM發(fā)病過程中與母體胰島素抵抗及高胰島素血癥的加重有關(guān)。

GDM不僅在孕期威脅孕婦和胎兒的健康，還會增加孕婦遠(yuǎn)期發(fā)生糖代謝異常的風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)后糖代謝異常同樣與胰島素抵抗有關(guān)，F(xiàn)an Y[17]和Lappas M[18]的研究分別證實(shí)GDM患者胰島素抵抗加重、細(xì)胞游離胰島素DNA水平增加與產(chǎn)后發(fā)展為2型糖尿病密切相關(guān)。本研究已經(jīng)證實(shí)胎盤及脂肪組織中HMGB1的高表達(dá)與GDM胰島素抵抗的加重有關(guān)，在此基礎(chǔ)上分析HMGB1與產(chǎn)后糖代謝異常的關(guān)系可知：產(chǎn)后6～8周糖代謝異常孕婦胎盤及脂肪組織中HMGB1的表達(dá)水平高于糖代謝正常孕婦。筆者分析認(rèn)為，脂肪組織中HMGB1的高表達(dá)可能在產(chǎn)后繼續(xù)分泌大量HMGB1進(jìn)入血液循環(huán)并引起胰島素抵抗、導(dǎo)致糖代謝異常；胎盤組織在分娩后離開母體，但本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎盤組織中HMGB1的高表達(dá)也與產(chǎn)后糖代謝異常有關(guān)，可能是孕期胎盤組織表達(dá)和釋放的HMGB1與脂肪組織存在關(guān)聯(lián)、作用于脂肪組織并放大了炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使脂肪組織的炎癥反應(yīng)持續(xù)處于放大激活狀態(tài)，并在產(chǎn)后繼續(xù)影響胰島素敏感性、引起胰島素抵抗。

綜上所述，本研究通過以上臨床樣本的檢測和分析發(fā)現(xiàn)GDM患者胎盤及脂肪組織中HMGB1高表達(dá)與母體血液循環(huán)中HMGB1增多、胰島素抵抗加重及產(chǎn)后糖代謝異常有關(guān)，但HMGB1造成胰島素抵抗的機(jī)制、對胎盤和脂肪組織中胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響、引起產(chǎn)后糖代謝異常的機(jī)制仍有待更多的研究。