孫協(xié)平，余 芯，周廣文，韓國強，江 波，羅友進

（1 長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶408100）（2 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）

硒是植物有益元素，既能促進植物生長，也能提高植物抗逆性[1-2]，其主要通過提高抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量來實現(xiàn)，與谷胱甘肽氧化循環(huán)關(guān)系密切。作為生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶之一的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX），可通過催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）生成還原型谷胱甘肽（GSH），消除自由基，阻斷自由基進一步損害機體[3-4]。在植物體內(nèi)，硒能提高谷胱甘肽氧化循環(huán)，進而提高抗氧化水平[5-7]。硒代蛋氨酸（Se-Met）分子式為C5H11NO2Se，是硒元素取代了蛋氨酸中硫元素而合成的一種氨基酸，也是硒在自然界中以有機形式存在于植物中的一種化合物，其生物利用效率較高[8]。同時Se-Met 比亞硒酸鈉毒性低，可代替亞硒酸鈉作為硒源，起到降低環(huán)境污染的作用[9]。

生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物的總稱，在促進機體生長，促進蛋白質(zhì)、RNA 及DNA 的合成，消除自由基，增強代謝等方面都有一定的作用[10]。色氨酸代謝過程中產(chǎn)生的色胺、5-羥色氨酸、N-乙酰-5 羥色胺、5-羥色胺（血清素）、5-甲氧色氨酸、褪黑素等[11-12]均屬于生物胺，具有多種生理功能。其中5-羥色胺廣泛分布于動物組織中，參與哺乳動物肌肉收縮、血壓調(diào)控以及消化系統(tǒng)中各器官的生理、病理調(diào)控等過程[13]。褪黑素是一種強大的抗氧化劑，能直接清除自由基[14-17]。

葡萄（Vitis viniferaL.）含有豐富的5-羥色胺、褪黑素等生物胺類物質(zhì)，其含量受到環(huán)境、品種等因素的影響[18-20]。陽光玫瑰葡萄品質(zhì)優(yōu)良、經(jīng)濟效益高，是我國主栽葡萄品種之一。本課題以該品種為試驗材料，分析比較硒代蛋氨酸對陽光玫瑰谷胱甘肽氧化循環(huán)等抗氧化能力方面和色氨酸代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)的含量的影響，并利用成本較低的富硒酵母（主要成分為硒代蛋氨酸）處理幼樹，分析對5-羥色胺到褪黑素合成相關(guān)酶活性的影響，以期明確硒代蛋氨酸對葡萄生理參數(shù)和色氨酸代謝的影響，從而為生產(chǎn)富硒高生物胺類物質(zhì)的葡萄提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

2018 年3 月3 日將陽光玫瑰葡萄枝條扦插于珍珠巖與蛭石（1∶10）為基質(zhì)的無紡布營養(yǎng)袋中，之后添加適量沙子，防止雜草與水分蒸發(fā)。5 月6 日將硒代蛋氨酸溶于水配制成溶液，并澆灌葡萄扦插幼苗，使基質(zhì)硒含量為1.0 mg/L，對照澆同等量的水。每個處理4 次重復(fù)，每2 株扦插苗為1 次重復(fù)，共計8 株。統(tǒng)一進行澆水、除草、施肥、打杈等常規(guī)管理，6 月20 日采集葡萄根系測定其抗氧化水平。2019 年1 月13 日（休眠期）去掉無紡布袋中原有基質(zhì)，對葡萄的根系和枝條進行適當(dāng)修剪，種植于7 加侖花盆中，基質(zhì)為園土、草炭、蛭石、珍珠巖（1∶2∶1∶1），放置于溫室中。2019 年8 月10 日分別采集對照和硒代蛋氨酸處理的葡萄葉片測定其抗氧化水平，以及色氨酸與5-羥色胺含量，每個處理3 次重復(fù)，每2 株為1 次重復(fù)，共計6 株。2019 年11 月15 日（休眠期）根據(jù)基質(zhì)體積計算富硒酵母用量，將其溶于2 L 水中進行澆灌，使基質(zhì)硒含量為1.0 mg/L，對照澆同等量的水，每個處理3 次重復(fù)，單株為1 次重復(fù)，共計3 株。2020 年8月10 日采集葡萄葉片和根系，測定褪黑素合成相關(guān)酶活性。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗氧化物質(zhì)和酶活性的測定

葡萄根系及葉片谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的含量以及總抗氧化水平（T-AOC）均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定[1]。

1.2.2 色氨酸、5-羥基色胺酸、色胺以及5-羥色胺含量的測定

利用高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄葉片中色氨酸和5-羥色胺含量。取適量樣品（約0.5 g）粉碎混勻，加入5 mL 0.4 mol/L 高氯酸溶液，放于超聲波萃取30 min，然后過0.45 μm 濾膜后，進樣。4種物質(zhì)均采用色譜柱syncronis C18（Dim 250 mm×4.6 mm，5 μm），進樣量為20 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長均為280 nm。色氨酸的流動相為水（0.05 mol/L 磷酸二氫鉀，用磷酸調(diào)pH 值至2.68）∶甲醇＝80∶20，5-羥基色胺酸和5-羥色胺的流動相均為水（0.5%磷酸）∶甲醇＝90∶10，色胺流動相為流動相A：90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液），流動相B：10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液）進行時間梯度淋洗[21]。其中，5-羥色氨酸的檢測線為0.56 μg/g，色胺的檢測線為0.943 μg/g。

1.2.3 褪黑素合成相關(guān)酶活性的測定

5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（SNAT）、N-乙酰-5-羥色胺-O-甲氧基轉(zhuǎn)移酶（ASMT）、芳香烷基胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶（AANAT）以及咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CAMT）活性均采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行測定[1]。其中SNAT 檢測范圍為5～180 IU/g、ASMT為1.5～50.0 IU/g、AANAT 為3～140 IU/g、CAMT為125～4 500 mU/g。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Origin 8.5 軟件分析數(shù)據(jù)，其中差異顯著性分析采用LSD 方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒代蛋氨酸對葡萄扦插苗根系谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

陽光玫瑰葡萄扦插苗根系與硒代蛋氨酸直接接觸后，谷胱甘肽氧化循環(huán)受到一定程度的促進作用，如表1 所示。硒代蛋氨酸處理雖然對谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及GSH/GSSG 比值、GSH＋GSSG 總量影響不顯著，但顯著提高了谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性（提高10.42%），顯著降低了谷胱甘肽還原酶（GR）活性（降低12.15%）。

表1 硒代蛋氨酸對葡萄扦插苗根系谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

2.2 硒代蛋氨酸對葡萄扦插苗根系抗氧化能力的影響

如表2 所示，硒代蛋氨酸處理降低了陽光玫瑰葡萄根系丙二醛（MDA）含量（降低0.40%）、總抗氧化能力（T-AOC，降低12.97%）和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）活性（降低1.25%），但與對照差異均未達到顯著水平。其中，過氧化氫酶（CAT）活性硒代蛋氨酸處理與對照出現(xiàn)了完全一致的現(xiàn)象。

表2 硒代蛋氨酸對葡萄扦插苗根系抗氧化能力的影響

2.3 硒代蛋氨酸對葡萄幼樹葉片谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

硒代蛋氨酸處理對葡萄幼樹葉片谷胱甘肽氧化循環(huán)起到明顯的促進作用（表3）。葉片谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性均顯著提高，分別提高8.62%、9.15%；氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量略微提高，谷胱甘肽還原酶（GR）活性略微降低，但均未達到顯著水平。硒代蛋氨酸處理后的葉片 GSH＋GSSG 含量提高9.06%，GSH/GSSG 比值增加8.22%，但均未達到顯著水平。

表3 硒代蛋氨酸對葡萄幼樹葉片谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

2.4 硒代蛋氨酸對葡萄幼樹葉片抗氧化能力的影響

如表4 所示，硒代蛋氨酸處理后陽光玫瑰葡萄幼樹葉片丙二醛（MDA）含量降低1.71%，總抗氧化能力（T-AOC）和過氧化氫酶（CAT）活性分別提高3.41%和7.39%，而谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）活性降低0.51%。硒處理下葡萄幼樹葉片4 個抗氧化參數(shù)與對照差異均未達到顯著水平。

表4 硒代蛋氨酸對葡萄幼樹葉片抗氧化能力的影響

2.5 硒代蛋氨酸對葡萄幼樹葉片色氨酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量的影響

從表5 可以看出，與對照相比，硒代蛋氨酸處理后的陽光玫瑰葡萄幼樹葉片色氨酸含量顯著降低（降低20.89%），而5-羥基色胺酸、色胺含量均低于檢測值。硒代蛋氨酸處理后葉片5-羥色胺含量顯著高于對照（提高869.57%）。

表5 硒代蛋氨酸對葡萄幼樹葉片色氨酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量的影響 μg/g

2.6 富硒酵母對葡萄葉片和根系褪黑素合成相關(guān)酶活性的影響

如表6 所示，富硒酵母處理顯著降低了陽光玫瑰葡萄葉片SNAT 活性（降低26.81%），對ASMT活性的影響甚微。富硒酵母處理后陽光玫瑰葡萄葉片AANAT 與CAMT 活性分別提高9.74%、19.44%，但均未達到顯著水平。

富硒酵母處理后陽光玫瑰葡萄根系SNAT 活性較對照降低19.39%，達到顯著水平。與對照相比，富硒酵母處理提高了陽光玫瑰葡萄根系A(chǔ)SMT 活性，提高幅度為9.76%，達到顯著水平。富硒酵母處理降低了陽光玫瑰葡萄根系A(chǔ)ANAT 活性（降低3.30%），提高了CAMT 活性（提高15.91%），但均未達到顯著水平（表6）。

表6 富硒酵母對葡萄葉片和根系褪黑素合成相關(guān)酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

在谷胱甘肽氧化循環(huán)中，GSH 在GPX 的催化下形成GSSG，GSSG 又在GR 的催化下合成GSH，在這過程中GSH、GPX 參與自由基的消除[3-4]。李孟奇[5]研究表明，不同類型硒處理能提高番茄植株GSH 含量、GPX 活性以及GSH/GSSG 比值，增強其總抗氧化能力。孫協(xié)平等[21]通過不同形態(tài)硒處理苗期青脆李，表明4種形態(tài)硒均能提高根系谷胱甘肽氧化循環(huán)效率，在大豆研究中也得到類似的結(jié)果[22]。在本研究中，硒代蛋氨酸處理對陽光玫瑰葡萄扦插苗根系和幼樹葉片的谷胱甘肽氧化循環(huán)有一定的促進作用。

植物體內(nèi)MDA 含量可用來分析細胞質(zhì)膜的過氧化程度[23]，MDA 含量越少說明植物細胞質(zhì)膜發(fā)生的過氧化作用越少。適當(dāng)補硒能夠明顯降低花椰菜植株MDA 含量[4]。本試驗中，硒代蛋氨酸處理的葡萄扦插苗根系和幼樹葉片MDA 含量均略低于對照，表明硒代蛋氨酸處理能夠降低葡萄細胞質(zhì)膜的過氧化程度。CAT、T-AOC 是判斷植物抗氧化能力的生理參數(shù)，本研究中經(jīng)硒代蛋氨酸處理的葡萄幼樹葉片抗氧化水平優(yōu)于扦插苗根系抗氧化水平，但均未達到顯著水平，這可能與硒的形態(tài)和濃度有關(guān)。GST 在毒理學(xué)上有一定的作用，如能催化還原型谷胱甘肽與多種親電、親脂底物結(jié)合，降低底物的毒性[24]。本研究中硒代蛋氨酸處理的葡萄根系和葉片的GST 含量均低于對照，但未達到顯著水平。

色氨酸在色氨酸脫羧酶、色氨酸羥化酶、羥化酶的催化下分別形成5-羥基色氨酸、色胺與5-羥色胺[11-12]。色胺是植物激素吲哚乙酸（IAA）的前體，能合成IAA，故與5-羥色胺的合成存在競爭關(guān)系[25]。在本研究中，硒代蛋氨酸處理后5-羥基色氨酸和色胺均未檢測出，但對色氨酸與5-羥色胺含量產(chǎn)生了顯著影響。有研究報道，不同類型硒處理能顯著增加番茄5-羥色胺含量，但對色氨酸影響不顯著[5]，本研究與其不同之處為硒處理顯著降低了色氨酸含量。而在青脆李上，低劑量的硒代蛋氨酸處理對色氨酸和5-羥色胺含量影響均不顯著[26]?？梢姴煌参铩⒉煌瑵舛任幚頃a(chǎn)生不同的結(jié)論。硒作為植物有益元素，在促進葡萄生長上也起到一定的作用，這可能是硒促進了IAA 的合成導(dǎo)致的，王海波等[27]研究指出有機硒處理對葡萄IAA 含量產(chǎn)生一定的促進作用。

褪黑素是一種強大的抗氧化劑，在植物中可以防止植物氧化脅迫[28]。孫協(xié)平等研究表明，外源硒對甜櫻桃葉片褪黑素含量有一定的調(diào)控作用[29]。從5-羥色胺合成褪黑素還需經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，涉及主要酶有SNAT、ASMT、CAMT、AANAT[11-12,28]，其中AANAT 是褪黑素合成的關(guān)鍵酶[30]。褪黑素的合成場所主要是線粒體和葉綠體[28]。本研究中葉片SNAT和AANAT活性均高于根系，而ASMT和CAMT活性均低于根系，存在器官差異，而且富硒酵母處理僅對褪黑素合成少部分酶活性（SNAT、ASMT）產(chǎn)生顯著影響。學(xué)術(shù)界對此也存在明顯的爭議，有研究表明硒能夠促進褪黑素合成，也有研究表明硒與褪黑素之間不存在必然聯(lián)系[31-32]。因此硒能否促進褪黑素的合成仍需要進一步研究。