賈銀海 張成福 張強(qiáng) 姬秋梅 黃光云 姜輝 文信旺 黃明光 彭夏云 吳柱月

摘要：【目的】從蛋白水平闡明牦?？购阅軝C(jī)理，并進(jìn)一步從營養(yǎng)學(xué)角度提高其代謝性能，為牦牛有效抵御外界惡劣氣候條件提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繎?yīng)用TMT蛋白組學(xué)技術(shù)對寒冷季節(jié)（1月）和溫暖季節(jié)（8月）的牦?？箖龅鞍走M(jìn)行挖掘，并對鑒定到的牦?？箖龅鞍走M(jìn)行亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、GO功能富集、KEGG信號通路注釋、蛋白相互作用等生物信息學(xué)分析。【結(jié)果】從牦牛耳組織中共鑒定獲得21856個(gè)肽段（Peptide），其中特有肽段（Unique peptide）序列為18452個(gè)，定量獲得4519個(gè)蛋白，最終篩選出144個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白89個(gè)、下調(diào)蛋白55個(gè)。144個(gè)牦牛抗凍差異蛋白亞細(xì)胞定位到7個(gè)條目上，分別是細(xì)胞核蛋白56個(gè)、細(xì)胞質(zhì)蛋白51個(gè)、質(zhì)膜蛋白24個(gè)、細(xì)胞外蛋白23個(gè)、線粒體蛋白18個(gè)、細(xì)胞骨架蛋白1個(gè)和溶酶體蛋白1個(gè);共鑒定到194個(gè)結(jié)構(gòu)域。GO功能富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要富集到細(xì)胞過程蛋白79個(gè)、代謝過程蛋白70個(gè)和生物調(diào)控蛋白42個(gè)等，分子功能主要富集到結(jié)合功能蛋白75個(gè)和催化活性蛋白64個(gè)等，細(xì)胞組分主要富集到細(xì)胞部分蛋白89個(gè)和細(xì)胞蛋白89個(gè)等。144個(gè)牦?？箖霾町惖鞍自贙EGG數(shù)據(jù)庫中注釋到205條KEGG信號通路，主要涉及核糖體、氮代謝、胞質(zhì)DNA感受、動(dòng)物體內(nèi)生熱作用、氧化磷酸化、白細(xì)胞介素-17及鈣離子信號等通路。牦牛抗凍差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)L8IHE5的關(guān)聯(lián)度最高，且冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（CIRP）和HSP70結(jié)合蛋白在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有更多的相互作用關(guān)系?！窘Y(jié)論】基于TMT蛋白組學(xué)對牦?？箖霾町惖鞍走M(jìn)行挖掘，結(jié)果鑒定獲得144個(gè)抗凍差異蛋白（上調(diào)蛋白89個(gè)，下調(diào)蛋白55個(gè)），其中CIRP和HSP70在冷應(yīng)激條件下呈上調(diào)趨勢，能促使牦牛肌體適應(yīng)低溫環(huán)境，可作為牦?？箖鲂杂N的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞： 牦牛;TMT蛋白組學(xué);生物信息學(xué);抗凍性;差異蛋白

中圖分類號： S823.85? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）01-0001-11

TMT proteomics and bioinformatics to analyze differential proteins in cold resistance of yaks

JIA Yin-hai1， ZHANG Cheng-fu2， ZHANG Qiang2， JI Qiu-mei2， HUANG Guang-yun1，JIANG Hui2， WEN Xin-wang1， HUANG Ming-guang1， PENG Xia-yun1， WU Zhu-yue1

（1Animal Husbandry Research Institute of Guangxi/Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement， Nanning? 530001， China; 2 Institute of Animal Science and Veterinary， Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences/State Key Laboratory of Hulless Barley and Yak Germplasm Resources and

Genetic Improvement， Lhasa? 850000， China）

Abstract：【Objective】To elucidate the mechanism of cold resistance of yak from protein level， and to further improve its metabolic performance from the perspective of nutrition， so as to provide scientific basis for yak to effectively resist harsh climate conditions. 【Method】The yak antifreeze proteins were extracted by TMT proteomics in cold season （January） and warm season（August）， and the subcellular localization analysis， domain analysis， GO functional analysis， KEGG signaling pathway annotation analysis ， protein interaction were analyzed. 【Result】A total of 21856 peptides were identified， of which 18452 were specific peptides and 4519 proteins were identified. There were 144 subcellular proteins， including 89 up-regulated proteins and 55 down-regulated proteins. 144 yak antifreeze differential proteins were subcellular mapped to 7 items， including 56 nuclear proteins， 51 cytoplasmic proteins， 24 plasma membrane proteins， 23 extracellular proteins， 18 mitochondrial proteins， 1 cytoskeleton protein and 1 lysosomal protein. A total of 194 domains were identified. GO enrichment of function analysis indicated that， biological process mainly enriched to cell protein 79， 70 metabolic process protein and 42 regulation protein， molecular function mainly enriched to combine functional protein 75? and 64 catalytic activity of the protein， cell component part mainly enriched to the 89 cell protein and 89 cell proteins. The 144 yak antifreeze differential proteins were annotated into 205 KEGG signaling pathways in KEGG database， which mainly involved in ribosomes， nitrogen metabolism， cytoplasmic DNA sensing， in vivo thermogenesis， oxidative phosphorylation， interleukin-17 and calcium ion signaling. It was found that L8IHE5 had the highest correlation， and cold-induced RNA-binding proteins（CIRP） and HSP70 binding protein had more interaction in the network. 【Conclusion】According to TMT proteomics， 144 differential antifreeze proteins（89 up-regulated proteins and 55 down-regulated proteins） are identified， among which CIRP and HSP70 are up-regulated under cold stress， which can promote yak body to adapt to low temperature environment， and can be used as candidate molecular markers for yak antifreeze breeding.3000D976-7878-45DE-B639-788EACCAAD63

Key words： yak; TMT proteomics; bioinformatics; cold resistance; differential proteins

Foundation items： Guangxi Science and Technology Major Special Project（Guike AA17204028）; Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences/State Key Laboratory of Hulless Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement Open-project（XZNKY-2020-C-007K05）

0 引言

【研究意義】牦牛具有很強(qiáng)的抗逆能力，屬于世界第三大極地動(dòng)物，是當(dāng)今世界未被污染的三大物種（北極熊、企鵝和牦牛）之一。青藏高原的牦牛數(shù)量占全球牦牛總量的90%以上。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年青藏高原1.2億ha的高寒草場上約有1600萬頭牦牛，是世界上重要的牦牛資源庫和主要生產(chǎn)基地（郝力仕，2019）。在藏區(qū)牧民經(jīng)濟(jì)中，牦牛的乳、肉、皮、毛、絨及其加工產(chǎn)品均是其他家畜無法替代;但高原氣候條件惡劣，冬季缺乏飼草料，導(dǎo)致牦牛營養(yǎng)不良及個(gè)體生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。低溫環(huán)境所引起的冷應(yīng)激，會(huì)導(dǎo)致牦牛抵抗能力降低及采食量下降，甚至致使懷孕牦牛流產(chǎn)等（賈銀海等，2021）。因此，揭示牦?？估溥m應(yīng)能力的作用機(jī)理，對保護(hù)牦牛品種資源及促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】動(dòng)物在受到冷應(yīng)激時(shí)，其機(jī)體通過增加產(chǎn)熱以維持體溫恒定。在冷應(yīng)激條件下，肌體會(huì)產(chǎn)生一系列變化，通過震顫或非震顫產(chǎn)熱（郝力仕，2019）。冷應(yīng)激不僅影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能，還會(huì)對動(dòng)物的免疫能力及抗氧化能力等造成不同程度的影響（郭爽等，2021;賈銀海等，2021）。決定動(dòng)物抗寒性的因素諸多，包括皮膚表面積、產(chǎn)熱性能、蒸發(fā)損耗、代謝損耗、脂肪厚度、皮膚厚度、體毛長度和細(xì)度及環(huán)境濕度等，許多動(dòng)物在低溫條件下可合成重結(jié)晶抑制效應(yīng)的抗凍蛋白，降低體內(nèi)的體液冰點(diǎn)，從而最大限度地保持體液的液體狀態(tài)（de Maayer et al.，2014）。至今，有關(guān)抗凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）的研究主要集中在魚類（Inglis et al.，2006;Gamham et al.，2008）、昆蟲（Meister et al.，2015）、植物（Ji et al.，2017;Sperotto et al.，2018）及菌類（Mu?oz et al.，2017）等物種上，其中又以魚類的研究最深入（鐘其旺和樊廷俊，2002;Martínez-Páramo et al.，2009;Duman，2015）。Kim等（2019）對南極魚亞目物種基因組中的高度保守核苷酸片段（Conserved nucleotide elements，CNEs）進(jìn)化模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南極魚類對血紅細(xì)胞發(fā)生過程的調(diào)控是適應(yīng)低溫的一個(gè)重要機(jī)制;Daane等（2020）研究表明，在長期的低溫環(huán)境下CNEs存在快速突變功能丟失的趨勢;Ren等（2021）從基因?qū)用骈_展研究，發(fā)現(xiàn)通路MAPK在魚類低溫應(yīng)激中占據(jù)重要位置，且可能與其他重要的通路如TGF-Bata等存在復(fù)雜聯(lián)系。在高寒地區(qū)，植物在面對低溫環(huán)境也會(huì)產(chǎn)生抗寒機(jī)制的產(chǎn)物，但其含量遠(yuǎn)低于魚類的抗凍蛋白（Ji et al.，2017）。在大部分昆蟲體內(nèi)都存在抗凍蛋白，其含量較魚類抗凍蛋白高10～100倍，且其蛋白結(jié)構(gòu)存在明顯差異（Meister et al.，2015）。此外，有研究已將抗凍蛋白添加至化妝品中，通過皮膚吸收能起到保護(hù)皮膚、防止皮膚凍傷的作用，即可用于高級防凍化妝品（Evans and Fletcher，2004;鞏子路，2015）?？梢姡箖龅鞍讓τ诓煌锓N發(fā)揮抗冷性能均有重要意義。【本研究切入點(diǎn)】不同物種為適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化，通常會(huì)產(chǎn)生應(yīng)對環(huán)境條件變化的相關(guān)產(chǎn)物，目前國內(nèi)外針對抗凍蛋白已有深入研究（鐘其旺和樊廷俊，2002;Martínez-Páramo et al.，2009;Duman，2015），但有關(guān)我國牦?？鼓嫘约捌淇箖龅鞍追矫娴难芯旷r見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于TMT（Tandem mass tag）蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)分析對牦?？箖龅鞍走M(jìn)行篩選研究，旨在闡明牦?？购阅軝C(jī)理，并進(jìn)一步從營養(yǎng)學(xué)角度提高其代謝性能，為牦牛有效抵御外界惡劣氣候條件提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試牦牛由西藏農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所改則縣古姆鄉(xiāng)和斯布牦牛養(yǎng)殖基地提供，分別于氣候寒冷的冬春季（1月）和氣候溫和的夏季（8月）采集6～8歲經(jīng)產(chǎn)牦牛耳組織樣品，各8頭，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆?。TMT分子標(biāo)記試劑盒購自美國ThermoFisher公司，BCA試劑盒購自南京諾威贊生物科技股份有限公司，乙腈和超純水購自Fisher Chemical公司，SDS、三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素及四乙基溴化銨等試劑購自Sigma公司。

1. 2 蛋白提取和肽段酶解

分別設(shè)寒冷季節(jié)組和溫暖季節(jié)組，其中，寒冷季節(jié)組3個(gè)重復(fù)（CON-1、CON-2和CON-3），溫暖季節(jié)組3個(gè)重復(fù)（T-1、T-2和T-3）。采用SDT裂解法（4% SDS，100 mmol/L Tris/HCl，0.1 mol/L DTT，pH 7.6）提取蛋白，取適量蛋白使用FASP（Filter aided proteome preparation）進(jìn)行胰蛋白酶酶解（Wi?niewski et al.，2009），并以C18 Cartridge對肽段進(jìn)行脫鹽;凍干后的肽段加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，應(yīng)用TMT標(biāo)記不同樣品中的同一蛋白，再以BCA法進(jìn)行定量分析（賈銀海，2018）。3000D976-7878-45DE-B639-788EACCAAD63

1. 3 TMT分子標(biāo)記

取100 μg肽段按TMT分子標(biāo)記試劑盒說明分別對各樣品進(jìn)行標(biāo)記（葛澤勇，2018）。RP（反相）分級：采用High pH Reversed-Phase Peptide Fractiona-tion Kit對TMT標(biāo)記的每組肽段等量混合后進(jìn)行分級（葛澤勇，2018）。以乙腈和0.1%三氟乙酸（TFA）進(jìn)行色譜柱平衡，將TMT標(biāo)記肽段混合樣品上樣，低速離心脫鹽，然后依次用不同梯度濃度的高pH乙腈溶液對結(jié)合肽段進(jìn)行梯度洗脫。真空干燥后，以12 μL 0.1%脂肪酸（FA）進(jìn)行復(fù)溶，于280 nm處測定肽段濃度。陽離子交換柱（SCX）分級：采用AKTA Purifier 100對TMT標(biāo)記的每組肽段混合后進(jìn)行分級（葛澤勇，2018）。緩沖液A液[10 mmol/L KH2PO4，25%乙腈，pH 3.0]，B液（10 mmol/L KH2PO4，500 mmol/L KCl，25%乙腈，pH 3.0）。A液平衡色譜柱，以1 mL/min的流速經(jīng)色譜柱進(jìn)行分離。B液梯度如下：0%，25 min;0%～10%，25～32 min;10%～20%，32～42 min;20%～45%，42～47 min;45%～100%，47～52 min;100%，52～60 min;60 min后B液重設(shè)為0%（蔣少秋，2020）。洗脫過程監(jiān)測214 nm處的吸光值（OD214），每隔1 min收集1次洗脫組分，凍干后采用C18 Cartridge進(jìn)行脫鹽（蔣少秋，2020）。

1. 4 LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集

采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC對每份樣品進(jìn)行分離（張弛，2020）。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為84%）。95%的A液平衡色譜柱，樣品通過進(jìn)樣器上樣至C18反相分析柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，nanoViper C18），采用B液線性梯度分離，以300 nL/min的流速流經(jīng)分析柱（Thermo Scientific EASY column，10 cm，ID75 μm，3 μm，C18-A2），再用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，并采集數(shù)據(jù)（楊重暉，2020）。

1. 5 蛋白鑒定及定量分析

采用Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4對質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定及定量分析（賈銀海，2018）。

1. 6 生物信息學(xué)分析

1. 6. 1 亞細(xì)胞定位分析 采用CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，即以多重支持向量機(jī)（multi-class SVM）的機(jī)器學(xué)習(xí)方法對公共數(shù)據(jù)庫中已知亞細(xì)胞定位信息的蛋白序列數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，預(yù)測待檢索蛋白亞細(xì)胞定位情況。

1. 6. 2 蛋白結(jié)構(gòu)域分析 使用Pfam數(shù)據(jù)庫的InterProScan數(shù)據(jù)包，采用運(yùn)行掃描算法對蛋白序列進(jìn)行功能表征預(yù)測，以獲得目標(biāo)蛋白序列在Pfam數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)域注釋信息。

1. 6. 3 GO功能富集分析 利用Blast2GO對目標(biāo)蛋白集合進(jìn)行GO功能富集分析，具體分析過程可歸納為序列比對（BLAST）、GO條目提取（Mapping）、GO注釋（Annotation）及InterProScan補(bǔ)充注釋（Annotation augmentation）等（賈銀海，2018）。

1. 6. 4 KEGG信號通路注釋分析 利用KAAS（KEGG automatic annotation server）對目標(biāo)蛋白集合進(jìn)行KEGG信號通路注釋分析（賈銀海，2018）。

1. 6. 5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 依據(jù)IntAct（http：//www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml）或STRING（http：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫分析蛋白間的連接數(shù)，預(yù)測蛋白與蛋白間的相互作用關(guān)系，同時(shí)以CytoScape 3.2.1繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖并進(jìn)行分析（賈銀海，2018）。

1. 6. 6 蛋白層次聚類分析 首先對目標(biāo)蛋白集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理，即歸一化至（-1，1）區(qū)間;使用ComplexHeatmap Version 3.4從抗凍差異蛋白樣本及其表達(dá)量2個(gè)維度進(jìn)行分類，并生成層次聚類熱圖（楊重暉，2020）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 牦牛抗凍蛋白鑒定結(jié)果

由圖1和圖2可知，經(jīng)Mascot 2.2鑒定和Proteome Discoverer 1.4定量分析共獲得433236張總譜圖（Total spectra）。其中蛋白譜圖（Spectra）45950張;肽段（Peptide）數(shù)量為21856個(gè)，其中特有肽段（Unique peptide）數(shù)量為18452個(gè);蛋白（Protein）數(shù)量為4527個(gè)，定量到的蛋白數(shù)量為4519個(gè)。對牦?？箖霾町惖鞍走M(jìn)行篩選，結(jié)果篩選獲得144個(gè)差異蛋白，其中上調(diào)蛋白89個(gè)、下調(diào)蛋白55個(gè)。

2. 2 亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

CELLO亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，144個(gè)牦?？箖霾町惖鞍锥ㄎ坏?個(gè)條目上（圖3），分別是細(xì)胞核（Nuclear）蛋白56個(gè)、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasmic）蛋白51個(gè)、質(zhì)膜（Plasma membrane）蛋白24個(gè)、細(xì)胞外（Extracellular）蛋白23個(gè)、線粒體（Mitochondrial）蛋白18個(gè)及其他蛋白2個(gè)[細(xì)胞骨架（Cytoskeleton）蛋白1個(gè)和溶酶體（Lysosome）蛋白1個(gè)]。

2. 3 蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

通過評價(jià)鑒定獲得蛋白在某個(gè)結(jié)構(gòu)域條目下的富集水平及對應(yīng)的差異蛋白，對牦?？箖霾町惖鞍走M(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定到194個(gè)結(jié)構(gòu)域，排名前20位的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖4所示。其中，Uteroglobin family（子宮珠蛋白家族）、Copper/zinc supero-xide dismutase（SODC）（銅/鋅超氧化物歧化酶）、Zn-finger in Ran binding protein and others（含鋅指 Ran 結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白）及Acetyltransferase（GANT）family（C-酰胺化酶家族）是機(jī)體參與抗凍應(yīng)答的相關(guān)蛋白。3000D976-7878-45DE-B639-788EACCAAD63

2. 4 GO功能富集分析結(jié)果

對牦?？箖霾町惖鞍走M(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果（圖5）顯示，生物過程（Biological process）主要富集到細(xì)胞過程（Cellular process）蛋白79個(gè)、代謝過程（Metabolic process）蛋白70個(gè)和生物調(diào)控（Biological regulation）蛋白42個(gè)等，分子功能（Molecular function）主要富集到結(jié)合功能（Binding）蛋白75個(gè)和催化活性（Catalytic activity）蛋白64個(gè)等，細(xì)胞組分（Cellular component）主要富集到細(xì)胞部分（Cell part）蛋白89個(gè)和細(xì)胞（cell）蛋白89個(gè)等。在生物過程中，Cellular carbohydrate metabolic process（細(xì)胞碳水化合物代謝過程）上調(diào)，而Energy reserve metabolic process（能量儲(chǔ)備代謝過程）、Oxidation-reduction process（氧化還原反應(yīng)過程）、Cellular glucan metabolic process（細(xì)胞糖代謝過程）、Regulation of glucose metabolic process（細(xì)胞糖代謝調(diào)控過程）及Cellular carbohydrate catabolic process（細(xì)胞碳水化合物分解代謝過程）等條目下調(diào);在分子功能中，Oxidoreductase activity（氧化還原酶活性）上調(diào)，而Antioxidant activity（抗氧化活性）、Transaminase activity（轉(zhuǎn)氨酶活性）及Catalytic activity（催化活性）等條目下調(diào);在細(xì)胞組分中，Integral component of membrane（膜的整體組分）及Intrinsic component of mem-brane（膜的內(nèi)在成分）等條目上調(diào)，而Mitochondrial outer membrane（線粒體外膜）、Postsynapse（突觸后膜）、Nuclear outer membrane-endoplasmic reticulum membrane network（核外膜—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)）等條目下調(diào)。

2. 5 KEGG信號通路注釋分析結(jié)果

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對牦牛抗凍差異蛋白進(jìn)行分類注釋，結(jié)果顯示共注釋到205條KEGG信號通路。表1為注釋獲得的前10條KEGG信號通路，主要涉及核糖體、氮代謝、胞質(zhì)DNA感受、動(dòng)物體內(nèi)生熱作用、氧化磷酸化、白細(xì)胞介素-17及鈣離子信號等通路。

2. 6 牦牛抗凍差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

由CytoScape 3.2.1繪制的牦?？箖霾町惖鞍紫嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（圖6）可看出，關(guān)聯(lián)度排名前10位的抗凍差異蛋白為L8IHE5、L8I961、A0A6B0RV13、A0A6B0RUX6、A0A6B0QW44、A0A6B0QZV0、L8I1Z6、A0A6B0RR94、A0A6B0RJ65和L8IPU4，關(guān)聯(lián)度最高的是L8IHE5。其中，A0A6B0RV13為冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（Cold inducible RNA binding protein，CIRP），L8I1Z6為HSP70結(jié)合蛋白。CIRP和HSP70蛋白在冷應(yīng)激條件下均呈上調(diào)趨勢，可作為牦牛抗凍性育種的候選蛋白基因。

2. 7 牦?？箖霾町惖鞍椎谋磉_(dá)量聚類分析結(jié)果

由圖7可知，對6個(gè)樣品組的抗凍差異蛋白定量數(shù)據(jù)（樣本維度和表達(dá)量維度）進(jìn)行分層聚類分析，每列代表1組樣品（橫坐標(biāo)為樣品信息），每行代表1個(gè)蛋白（縱坐標(biāo)為顯著差異表達(dá)蛋白），其中，紅色代表顯著上調(diào)蛋白，藍(lán)色代表顯著下調(diào)蛋白，灰色部分代表無蛋白信息。分層聚類分析結(jié)果顯示：寒冷季節(jié)組（CON-1、CON-2和CON-3）牦?？箖霾町惖鞍妆磉_(dá)量的上調(diào)和下調(diào)趨勢較一致，CON-2和CON-3先聚為一類，再與CON-1聚為一類;溫暖季節(jié)組（T-1、T-2和T-3）牦?？箖霾町惖鞍妆磉_(dá)量的上調(diào)或下調(diào)趨勢與寒冷季節(jié)的基本一致，T-2和T-3先聚為一類，再與T-1聚為一類，最終形成與寒冷季節(jié)組（CON-1、CON-2和CON-3）明顯不同的簇。

3 討論

TMT是Thermo Scientific公司推出的一種應(yīng)用廣泛、基于體外同位素標(biāo)記的相對與絕對定量蛋白組學(xué)技術(shù)，利用同位素試劑標(biāo)記蛋白酶解后產(chǎn)生的多肽，可同時(shí)比對分析多達(dá)16種樣品間的蛋白表達(dá)量（Ross et al.，2004）。TMT標(biāo)記的不同樣本中同一蛋白均表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比，等量混勻后，經(jīng)高質(zhì)量、高精度和高分辨率的質(zhì)譜分析，可保持良好的質(zhì)量偏差，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠;經(jīng)數(shù)據(jù)庫分析即可獲得不同樣本中各蛋白的相對定量比值，進(jìn)而篩選出差異表達(dá)蛋白。本研究采用TMT結(jié)合液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法成功對牦牛耳組織蛋白進(jìn)行分離和鑒定，結(jié)果鑒定獲得特有肽段（Unique peptide）序列18452個(gè)，鑒定獲得4527個(gè)蛋白（Protein），其中定量到的蛋白數(shù)量為4519個(gè)?？梢?，TMT可標(biāo)記所有肽段，適用于任何類型的樣本鑒定，具有高通量的特點(diǎn)，且可信度高。

本研究應(yīng)用TMT蛋白組學(xué)技術(shù)對寒冷季節(jié)和溫暖季節(jié)的牦?？箖龅鞍走M(jìn)行挖掘，并對鑒定到的牦牛抗凍蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、GO功能富集及KEGG信號通路注釋等生物信息學(xué)分析。在亞細(xì)胞定位分析中，144個(gè)牦牛抗凍差異蛋白共鑒定到7個(gè)條目上，分別是細(xì)胞核蛋白56個(gè)、細(xì)胞質(zhì)蛋白51個(gè)、質(zhì)膜蛋白24個(gè)、細(xì)胞外蛋白23個(gè)、線粒體蛋白18個(gè)、細(xì)胞骨架蛋白1個(gè)及溶酶體蛋白1個(gè)。在結(jié)構(gòu)域分析中，共鑒定到194個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中，子宮珠蛋白家族上調(diào)，可能與動(dòng)物肌體防御外界不同環(huán)境條件變化，促進(jìn)肺組織發(fā)育及提高自身免疫力有關(guān)（厲雙慧等，2020）;銅/鋅超氧化物歧化酶和C-酰胺化酶家族下調(diào)，則與高寒缺氧條件下機(jī)體內(nèi)攝入的抗氧化營養(yǎng)素（銅和鋅）不足，不能維持自由基低濃度的動(dòng)態(tài)平衡，新陳代謝功能及抵抗力降低有關(guān)，與賈銀海等（2021）研究牦牛毛微量元素與其抗寒性能的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致。GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物過程中，細(xì)胞碳水化合物代謝過程上調(diào)，而能量儲(chǔ)備代謝過程、氧化還原反應(yīng)過程、細(xì)胞糖代謝過程、細(xì)胞糖代謝調(diào)控過程及細(xì)胞碳水化合物分解代謝過程等下調(diào);在分子功能中，氧化還原酶活性上調(diào)，而抗氧化活性、轉(zhuǎn)氨酶活性及催化活性等下調(diào);在細(xì)胞組分中，膜的整體組分和膜的內(nèi)在成分等上調(diào)，線粒體外膜、突觸后膜及核外膜—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)等則下調(diào)。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對牦?？箖霾町惖鞍走M(jìn)行分類注釋，結(jié)果共注釋到205條KEGG信號通路，主要涉及核糖體、氮代謝、胞質(zhì)DNA感受、動(dòng)物體內(nèi)生熱作用、氧化磷酸化、白細(xì)胞介素-17及鈣離子信號等通路。3000D976-7878-45DE-B639-788EACCAAD63

本研究還鑒定出冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（CIRP），該蛋白是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)首個(gè)發(fā)現(xiàn)的冷休克蛋白，由172個(gè)氨基酸殘基組成，含有2個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域（Lee et al.，2015）。已有研究表明，缺氧、紫外線輻射、缺糖、熱應(yīng)激和過氧化氫均可調(diào)節(jié)大鼠血清中CIRP的表達(dá)，提示CIRP是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白（Lleonart，2010）。在應(yīng)激條件下，腸系膜細(xì)胞可從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)，通過其靶基因3'端的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性（Sakurai et al.，2006）。CIRP參與多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、端粒維持及腫瘤的形成和發(fā)展（Lleonart，2010）。CIRP在25 ℃下被誘導(dǎo)產(chǎn)生（Sakurai et al.，2006），特別是在低溫、缺氧和強(qiáng)紫外線的脅迫下，其表達(dá)量顯著增加，表明冷誘導(dǎo)產(chǎn)生的CIRP能促使牦牛肌體適應(yīng)低溫環(huán)境（Al-Fageeh and Smales，2009）。

熱休克蛋白（HSPs）是由細(xì)胞核內(nèi)高度保守的熱應(yīng)激基因所編碼（Lanneau et al.，2008）。HSPs作為蛋白分子伴侶存在，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白肽鏈空間結(jié)構(gòu)的形成，促進(jìn)蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移動(dòng)，對調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用（黃建芳等，2015;伍鋼等，2020）。此外，HSPs能被冷應(yīng)激過后的復(fù)溫過程所誘導(dǎo)（Lanneau et al.，2008）。在冷應(yīng)激條件下HSPs能迅速表達(dá)，因此可作為冷應(yīng)激反應(yīng)的分子生物標(biāo)記。本研究從牦牛耳組織蛋白中鑒定獲得HSP70、HSP90、HSP110和HSP27，尤其是HSP70當(dāng)肌體受到冷應(yīng)激時(shí)會(huì)顯著升高，與其能與細(xì)胞內(nèi)其他分子以不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)結(jié)合有關(guān)。

4 結(jié)論

基于TMT蛋白組學(xué)對牦?？箖霾町惖鞍走M(jìn)行挖掘，結(jié)果鑒定獲得144個(gè)抗凍差異蛋白（上調(diào)蛋白89個(gè)，下調(diào)蛋白55個(gè)），其中CIRP和HSP70在冷應(yīng)激條件下呈上調(diào)趨勢，能促使牦牛肌體適應(yīng)低溫環(huán)境，可作為牦?？箖鲂杂N的候選分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）3000D976-7878-45DE-B639-788EACCAAD63